成娟麗，林金水

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安 716000）

目前，各類微生物制劑被用于提高青貯玉米發(fā)酵效率，其中乳酸菌菌劑作為最安全有效的添加劑常被應(yīng)用于各類青貯飼料。然而，這種類型微生物制劑產(chǎn)生較少的較強(qiáng)抗真菌特性的有機(jī)酸，會(huì)使青貯飼料在開窖后變得不穩(wěn)定。相比之下，有研究報(bào)道，在青貯飼料中添加布氏乳酸菌（Lactobacillus buchneri，異型發(fā)酵乳酸菌）可以通過(guò)厭氧生產(chǎn)乙酸來(lái)提高好氧穩(wěn)定性（王旭哲等，2018）。大部分學(xué)者已經(jīng)肯定并接受了布氏乳桿菌對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的積極作用，但仍有學(xué)者認(rèn)為其會(huì)造成干物質(zhì)損失（Kleinschmit 和Kung，2006）。有研究發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)在青貯飼料中混合添加微生物制劑解決干物質(zhì)損失這一問(wèn)題。Filya（2013）發(fā)現(xiàn)，將布氏乳酸菌與植物乳桿菌混合添加到玉米青貯中會(huì)降低干物質(zhì)含量，但減低程度小于布氏乳酸菌單獨(dú)添加組。張淑枝等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和乳酸片球菌的接種劑能顯著提高玉米青貯飼料的干物質(zhì)含量。因此，本試驗(yàn)的目的是比較布氏乳桿菌與乳酸片球菌或植物乳桿菌聯(lián)用對(duì)玉米青貯發(fā)酵、好氧穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 青貯玉米原料：試驗(yàn)選用新飼玉10號(hào)作為青貯原料。在青貯玉米干物質(zhì)含量約為320 g/kg時(shí)收割并切碎。微生物添加劑：布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 3個(gè)容量為20 L的筒倉(cāng)用于青貯玉米。試驗(yàn)分為3個(gè)處理：（1）對(duì)照組，不加任何菌劑；（2）布氏乳桿菌+乳酸片球菌組，添加量分別為 4×105、1×105CFU/g；（3）布氏乳桿菌 +植物乳桿菌組，添加量分別為 4×105、1×105CFU/g。各菌種在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，平板計(jì)數(shù)后確定其數(shù)量后按比例配置菌液。菌液與去離子水混合后用滅菌噴壺均勻噴灑至待貯青貯玉米表面，對(duì)照組處理噴灑等量的去離子水。每個(gè)筒倉(cāng)內(nèi)裝大約15 kg的濕飼料，以達(dá)到230 kg干物質(zhì)/m3的包裝密度，記錄空倉(cāng)和滿倉(cāng)的重量。將筒倉(cāng)用氧氣隔離塑料密封，室溫15～28℃青貯。180 d后對(duì)所有筒倉(cāng)稱重，分離頂部可見(jiàn)的腐敗物并稱重。筒倉(cāng)重量減去可見(jiàn)變質(zhì)青貯飼料的重量是發(fā)酵后剩余青貯飼料的重量。將青貯飼料部分沒(méi)有可見(jiàn)腐壞部分充分混合，并采集樣品進(jìn)行分析。干物質(zhì)回收率計(jì)算公式如下：

干物質(zhì)回收率/%＝[（開封時(shí)回收青貯重×青貯干物質(zhì)%）／（裝填時(shí)裝入原料重×原料干物質(zhì) %）]×100。

1.3 測(cè)定方法 干物質(zhì)含量采用105℃烘干法測(cè)定；粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測(cè)定；淀粉采用酶水解法測(cè)定；利用酸度計(jì)測(cè)定pH；揮發(fā)性脂肪酸、乙醇和1，2-丙二醇用液相色譜法測(cè)定采用高效液相色譜法；氨態(tài)氮采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定；水溶性碳水化合物蒽酮比色法測(cè)定；中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維采用范氏洗滌纖維法測(cè)定；采用離體法測(cè)定玉米青貯飼料樣品中中性纖維消化率；微生物數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，乳酸菌（30℃，48～ 72 h）、霉菌（32℃，48～ 72 h）、酵母菌（32℃，48～72 h）分別用MRS培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、麥芽糖浸粉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。選擇菌落數(shù)在30～300個(gè)平板為平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。有氧穩(wěn)定性測(cè)定主要觀測(cè)各處理開倉(cāng)后溫度變化，青貯飼料溫度高于環(huán)境溫度2℃所用的時(shí)間即為有氧穩(wěn)定時(shí)間。取筒倉(cāng)底部3 kg飼料至新筒倉(cāng)中，將多點(diǎn)式溫度記錄儀器多個(gè)探頭至于飼料中心，每10 min記錄一次溫度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，利用SAS一般線性模型進(jìn)行方差分析。Tukey’s進(jìn)行差異性比較，以P＜0.05作為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米青貯原料微生物數(shù)量和營(yíng)養(yǎng)組成 由表1所示，全株玉米干物質(zhì)的含量為325 g/kg，其他營(yíng)養(yǎng)成分均在正常范圍內(nèi)。

表1 玉米青貯原料微生物數(shù)量和營(yíng)養(yǎng)組成

表2 布氏乳桿菌與不同乳酸菌聯(lián)用對(duì)玉米青貯感官評(píng)定

2.2 布氏乳桿菌與不同乳酸菌聯(lián)用對(duì)玉米青貯感官評(píng)定 由表2所示，3組青貯玉米在氣味質(zhì)地上均差異不大，僅在顏色、酸味、質(zhì)地3項(xiàng)指標(biāo)有略微差別。相比于接種乳酸菌制劑組，未經(jīng)處理的青貯飼料筒倉(cāng)表面有相當(dāng)大比例的青貯飼料明顯變質(zhì)。綜合感官評(píng)定結(jié)果為對(duì)照組為良好，布氏乳桿菌+乳酸片球菌組為優(yōu)等，布氏乳桿菌+植物乳桿菌組為優(yōu)等。

2.3 布氏乳桿菌與不同乳酸菌聯(lián)用對(duì)玉米青貯干物質(zhì)回收率、養(yǎng)分含量及中性纖維消化率的影響 由表3所示，與對(duì)照組相比，布氏乳桿菌+乳酸片球菌組顯著增加了（P＜0.05）干物質(zhì)回收率，顯著降低了（P＜0.05）水溶性碳水化合物含量；布氏乳桿菌+植物乳桿菌組顯著增加了（P＜0.05）干物質(zhì)回收率、酸性洗滌纖維含量、中性纖維消化率，顯著降低了（P＜0.05）水溶性碳水化合物含量；氮、氨態(tài)氮、中性洗滌纖維的含量不受各組處理影響（P＞0.05）。

表3 布氏乳桿菌與不同乳酸菌聯(lián)用對(duì)玉米青貯干物質(zhì)回收率、養(yǎng)分含量及中性纖維消化率的影響??????????????????????????????????g/kg

2.4 布氏乳桿菌與不同乳酸菌聯(lián)用對(duì)玉米青貯微生物數(shù)量的影響 由表4所示，與對(duì)照組相比，布氏乳桿菌+乳酸片球菌組與布氏乳桿菌+植物乳桿菌組顯著增加了（P＜0.05）乳酸菌的數(shù)量，而酵母的數(shù)量極低，幾乎無(wú)法檢測(cè)到（P＜0.05）。霉菌數(shù)量不受各組處理影響（P＞0.05）。以上指標(biāo)在布氏乳桿菌+乳酸片球菌組和布氏乳桿菌+植物乳桿菌組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 布氏乳桿菌與不同乳酸菌聯(lián)用對(duì)玉米青貯?????????????微生物數(shù)量的影響????log?CFU/g

2.5 布氏乳桿菌與不同乳酸菌聯(lián)用對(duì)pH、發(fā)酵產(chǎn)物和有氧穩(wěn)定性的影響 由表5所示，與對(duì)照組相比，布氏乳桿菌+乳酸片球菌組和布氏乳桿菌+植物乳桿菌組顯著降低了（P＜0.05）pH、乙醇含量，顯著增加了（P＜0.05）乙酸含量、1，2-丙二醇和有氧穩(wěn)定性。與布氏乳桿菌+植物乳桿菌組相比，布氏乳桿菌+乳酸片球菌組顯著增加了（P＜ 0.05）pH、乙酸含量、1，2-丙二醇含量，顯著降低了（P＜0.05）乙醇含量、乳酸含量。

表5 布氏乳桿菌與不同乳酸菌聯(lián)用對(duì)pH、發(fā)酵產(chǎn)物和有氧穩(wěn)定性的影響

3 討論

近年來(lái)，為提高有氧穩(wěn)定性并防止青貯飼料變質(zhì)，布氏乳桿菌作為青貯添加劑添加到青貯飼料中（洪梅等，2011）。但有研究發(fā)現(xiàn)，添加布氏乳桿菌會(huì)導(dǎo)致更高的干物質(zhì)損失。Kleinschmit 和Kung（2006）利用薈萃分析發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的青貯飼料相比，青貯飼料中添加布氏乳桿菌會(huì)降低干物質(zhì)回收率。一些研究發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌與其他乳酸菌劑聯(lián)合使用可以彌補(bǔ)布氏乳桿菌單獨(dú)添加造成的發(fā)酵損失（Driehuis等，2001）。本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致，布氏乳桿菌植物乳桿菌或乳酸片球菌聯(lián)用可提高干物質(zhì)回收率。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，有氧穩(wěn)定性代表青貯飼料對(duì)溫度升高的抵抗力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，布氏乳桿菌植物乳桿菌或乳酸片球菌聯(lián)用可提高玉米青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。青貯飼料主要依靠乳酸菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，抑制不良微生物生長(zhǎng)，減少營(yíng)養(yǎng)損失。植物乳桿菌和乳酸片球菌均為同型發(fā)酵乳酸菌，它們?cè)诎l(fā)酵過(guò)程中占主導(dǎo)地位，使乳酸成為主要的發(fā)酵產(chǎn)物。Wang等（2015）在有氧暴露期間，同型發(fā)酵乳酸菌所產(chǎn)生的乳酸可作為酵母菌生長(zhǎng)的底物，僅產(chǎn)生少量能抑制酵母菌和霉菌生長(zhǎng)的短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸）。而異型發(fā)酵的布氏乳桿菌在青貯飼料中成為優(yōu)勢(shì)菌群后通過(guò)顯著增加乙酸和1，2-丙二醇濃度，產(chǎn)生細(xì)菌素或類細(xì)菌，有助于提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性并改善青貯品質(zhì)。因此，該結(jié)果表明，布氏乳桿菌在青貯中占主導(dǎo)地位。后續(xù)的微生物及發(fā)酵產(chǎn)物等數(shù)據(jù)也證實(shí)了這一結(jié)論。與未處理的玉米青貯飼料相比，布氏乳桿菌和乳酸片球菌或植物乳桿菌聯(lián)合接種顯著增加了玉米青貯飼料中乳酸菌的數(shù)量，乙酸和1，2-丙二醇濃度，顯著降低了pH、酵母數(shù)量和乳酸濃度。Schmidt等（2008）通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌數(shù)量在其接種的青貯飼料中顯著提高，在發(fā)酵第240天已成為飼料中的主導(dǎo)菌群。我們還發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌+乳酸片球菌組在增加乙酸1，2-丙二醇含量，降低乙醇含量、乳酸含量等指標(biāo)優(yōu)于布氏乳桿菌+植物乳桿菌組。然而，Shockey等（1985）研究表明，玉米青貯添加乳酸片球菌和植物乳桿菌不影響乳酸及乙酸濃度，對(duì)于pH的降低也無(wú)影響。因此，該作用機(jī)制需進(jìn)一步探索。

此外，布氏乳桿菌和乳酸片球菌或植物乳桿菌聯(lián)合添加對(duì)青貯飼料中氮和氨態(tài)氮的含量未有影響，與Kleinschmit和Kung（2006）報(bào)道相似，該研究發(fā)現(xiàn)，在玉米和小谷物類等青貯飼料中單獨(dú)接種布氏乳桿菌并未影響氮和氨態(tài)氮。水溶性碳水化合物含量在接種布氏乳桿菌和乳酸片球菌或植物乳桿菌的青貯飼料中減少，可能與該組青貯玉米含有較高發(fā)酵微生物有關(guān)。與未處理的玉米青貯相比，聯(lián)合接種布氏乳桿菌和乳酸片球菌或植物乳桿菌不影響玉米青貯的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，可能與植物乳桿菌和乳酸片球菌接種劑通常對(duì)纖維無(wú)降解能力有關(guān)。該結(jié)果與前人報(bào)道一致（Kleinschmit 等，2005；Ranjit和 Kung，2000）。

除了提高干物質(zhì)回收率和好氧穩(wěn)定性，一些微生物制劑還可提高青貯飼料的消化率。Weinberg等（2007）提出，一些添加到青貯飼料的微生物制劑可能通過(guò)與瘤胃中的微生物競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致乳酸含量降低，瘤胃pH升高，有利于瘤胃的纖維溶解細(xì)菌生長(zhǎng)。因此，青貯飼料中接種微生物制劑可以提高纖維在瘤胃中的消化。Weinberg等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，在玉米青貯飼料中添加布氏乳桿菌可提高體外瘤胃對(duì)中性洗滌纖維的消化。但一些研究發(fā)現(xiàn)，在玉米青貯飼料中添加布氏乳桿菌對(duì)纖維消化沒(méi)有影響。Nsereko等（2008）提出，在青貯飼料中添加表達(dá)阿魏酸酯酶的乳酸菌可以提高纖維消化率。這種酶有可能從木質(zhì)素中分離半纖維素來(lái)提高纖維的消化率。布氏乳桿菌菌株P(guān)TA6138具有阿魏酸酯酶活性，與干酪乳桿菌PTA6315聯(lián)用可以提高玉米青貯飼料的中性纖維消化率（Kang等，2009）。本試驗(yàn)中未對(duì)該布氏乳桿菌株是否具有阿魏酸酯酶活性進(jìn)行驗(yàn)證，布氏乳桿菌和乳酸片球菌聯(lián)用對(duì)中性纖維消化率無(wú)影響，而布氏乳桿菌和植物乳桿菌聯(lián)用可提高中性纖維消化率，該結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，布氏乳桿菌與植物乳桿菌或乳酸片球菌聯(lián)用可提高干物質(zhì)回收率、改善玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)、降低有害微生物數(shù)量、提高有氧穩(wěn)定性。