吳 芳 ，羅定強(qiáng) ，李 青 ，趙珊珊 ，劉海靜 ，

（1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710061； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046）

小兒化毒膠囊有清熱解毒、活血消腫功效，用于小兒疹后余毒未盡、煩躁、口渴、口瘡、便秘等癥。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)（第50冊）》，原處方規(guī)定使用牛黃投料，后根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局相關(guān)文件，經(jīng)批準(zhǔn)將處方中的牛黃修改為人工牛黃進(jìn)行投料，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)為使用薄層色譜法測定人工牛黃中膽酸的含量，方法的專屬性和重復(fù)性均欠佳。該品種的系列制劑小兒化毒散現(xiàn)收載于2015年版《中國藥典（一部）》，標(biāo)準(zhǔn)中亦缺少對(duì)人工牛黃的定量控制方法[1]。小兒化毒膠囊為兒科用藥，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)予以更合理和嚴(yán)格的控制。本研究中采用蒸發(fā)光散射檢測器－高效液相色譜（ELSD－HPLC）法同時(shí)測定方中膽酸和豬去氧膽酸的含量，方法科學(xué)、簡便，可有效控制小兒化毒膠囊中人工牛黃的質(zhì)量，并可為同系列制劑提供方法依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters1525／2487型高效液相色譜儀，Empower色譜工作站（美國 Waters公司）；BS224S型，BS223S型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Alltech ELSD3300ES蒸發(fā)光散射檢測器（美國奧泰科技＜中國＞有限公司）。

1.2 試藥

膽酸對(duì)照品（批號(hào)為 100078－201415，含量為98.9%），豬去氧膽酸對(duì)照品（批號(hào)為100087－200610，含量為97.3%），均由中國食品藥品檢定研究院提供。小兒化毒膠囊樣品共9批（批號(hào)分別為20091，10021，60161，10011，10061，10031，10051，60171，20081），陰性樣品及人工牛黃藥材均由西安碑林藥業(yè)股份有限公司提供，且由羅定強(qiáng)副主任藥師鑒定，符合藥典相關(guān)規(guī)定。乙腈為色譜純（Avantor Performance Materials Sda Bhd），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2－5]

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 －0.1% 冰醋酸溶液（40 ∶60）；ELSD 漂移管溫度：98℃；空氣流速：3.0 mL／min；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取膽酸對(duì)照品和豬去氧膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中各含0.2 mg的溶液，搖勻，即得。

供試品溶液與陰性對(duì)照品溶液：分別取小兒化毒膠囊內(nèi)容物、陰性樣品適量，研細(xì)，取約3 g；人工牛黃研細(xì)，取約 45 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，水浴加熱回流30 min，放冷，濾過，用適量甲醇洗滌容器和濾紙，合并濾液，蒸至近干，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，搖勻，濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取膽酸對(duì)照品10.80 mg（含量為98.9%），豬去氧膽酸對(duì)照品11.52 mg（含量為97.3%），精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，折純度后質(zhì)量濃度分別為1.068 g／L和1.121 g／L；分別吸取 1，2，3，5，8，10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)行測定，以對(duì)照品進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值的對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：膽酸 Y＝1.46X＋5.83（r＝0.999），豬去氧膽酸 Y＝1.46 X＋5.68（r＝0.999），膽酸進(jìn)樣量線性范圍為1.068～10.680 μg，豬去氧膽酸進(jìn)樣量線性范圍為 1.121 ～ 11.210 μg。

專屬性試驗(yàn)：取陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果未出現(xiàn)與對(duì)照品溶液色譜中膽酸與豬去氧膽酸對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件操作，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果膽酸和豬去氧膽酸峰面積積分值的 RSD分別為2.90%和2.28%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱取同一供試品（批號(hào)為20081），依法制備供試品溶液，分別于配制后每隔4 h測定。結(jié)果膽酸和豬去氧膽酸峰面積積分值的 RSD分別為3.0%和2.1%（n＝6），表明供試品溶液在20 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20081）樣品6份，依法制備供試品溶液,測定。結(jié)果膽酸的平均含量為0.774 mg／g，RSD 為 2.23% （n＝6）；豬去氧膽酸的平均含量為 1.050 mg／g，RSD 為 2.71% （n＝6）。平均裝量為0.312 2 g，每粒含有膽酸和豬去氧膽酸的總量為0.570 mg。

加樣回收試驗(yàn)：取膽酸對(duì)照品14.54 mg，豬去氧膽酸對(duì)照品14.60 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取6份溶液各1 mL，置錐形瓶中，再精密稱取6份樣品（批號(hào)為20081）各1 g，分別依次置上述錐形瓶中，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測定。結(jié)果見表1。

2.4 膽酸和豬去氧膽酸轉(zhuǎn)移率

取人工牛黃藥材適量，制備供試品溶液，測得人工牛黃中膽酸的含量為5.05%，豬去氧膽酸的含量為7.23%。按其含量及處方進(jìn)行計(jì)算，樣品中膽酸的轉(zhuǎn)移率為96.5%，豬去氧膽酸的轉(zhuǎn)移率為91.5%。

2.5 樣品含量與限度測定

依法測定8批樣品含量，結(jié)果為每粒0.570～0.659 mg。按此結(jié)果，考慮批間差異、藥材差異等的影響，含量限度暫定為：本品每粒含人工牛黃以膽酸（C24H40O5）和豬去氧膽酸（C20H27O11）的總量計(jì)，不得少于0.40 mg。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3 討論

人工牛黃中的膽酸為膽甾酸類成分，分子結(jié)構(gòu)中無共軛雙鍵，在紫外－可見光區(qū)吸收不明顯。《中國藥典（一部）》人工牛黃項(xiàng)下收載的含量測定方法及方法后附的原料含量測定方法均為采用糠醛溶液顯色后進(jìn)行紫外測定。另有采用薄層色譜法[6]或高效液相色譜－紫外檢測（HPLC－UV）法測定膽酸和豬去氧膽酸的含量[7－8]。但經(jīng)試驗(yàn)，兩者色譜峰在紫外檢測器下響應(yīng)值很低，且受其他成分干擾，色譜峰幾乎難以辨認(rèn)。在蒸發(fā)光散射檢測器下信號(hào)較強(qiáng)，色譜峰響應(yīng)值較大，與周圍色譜峰分離良好。故蒸發(fā)光散射檢測器用來測定膽酸類物質(zhì)較為理想[9]。

考察超聲提取30 min、回流提取30 min、回流提取40 min 3種提取方式，結(jié)果回流提取30 min制備的供試品溶液中膽酸和豬去氧膽酸的含量最高。根據(jù)測定結(jié)果，選定回流提取30 min為溶液的提取方式。

人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬帷⒛懠t素、膽固醇、微量元素等加工制成[1]，膽酸和豬去氧膽酸為其中含量最高的2種化學(xué)成分，質(zhì)量控制方法研究較成熟[10－12]。人工牛黃為天然牛黃的代用品，部分含有天然牛黃的制劑品種使用人工牛黃進(jìn)行替代，但標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下并未進(jìn)行相應(yīng)的檢驗(yàn)檢測項(xiàng)目的完善和提高，建議應(yīng)及時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)提高工作，完善人工牛黃的質(zhì)量控制方法。