鄧冬艷, 鄧鵬翅, 宋紅杰, 齊 悅

(1. 四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610064; 2. 四川大學(xué) 分析測試中心, 四川 成都 610064)

卵磷脂是一種含磷的極性脂類物質(zhì),包括磷脂酰膽堿( PC) 、磷脂酰乙醇胺( PE) 、磷脂酸( PA) 和磷脂酰肌醇(PI)等,由法國人Gobley于1846—1847年從腦和蛋黃中首先發(fā)現(xiàn)[1]。

卵磷脂具有重要的營養(yǎng)保健功能,能夠改善機(jī)體的神經(jīng)功能、提高大腦活動、防止心血管疾病等,被譽為與蛋白質(zhì)、維生素并列的“第三營養(yǎng)素”。卵磷脂主要存在于大豆、菜籽、堅果、蛋黃及動物腦等物質(zhì)中[2]。卵磷脂主要包括蛋黃卵磷脂和大豆卵磷脂。卵磷脂制備方法主要有:有機(jī)溶劑萃取法、柱層析法、乙?；ā?fù)合鹽沉淀法以及超臨界二氧化碳萃取法等[3]。目前, 對卵磷脂相關(guān)食品中磷脂酰膽堿含量的測定還沒有國標(biāo)方法, 國內(nèi)外在這方面的報道較少, 如采用薄層掃描、高效液相色譜法(HPLC)、分光光度法等,這些方法存在操作繁瑣、分析時間長、干擾大、分離不好等缺點,檢測效果不夠理想。因此,尋找更加簡單、方便的分析方法具有很高的應(yīng)用價值[4]。

核磁共振技術(shù)定性定量分析法逐漸得到重視[5-7]。雖然該方法測定誤差比HPLC大,但其仍然存在顯著優(yōu)勢,包括需要的樣品量很少、掃描時間短、不需要標(biāo)準(zhǔn)品,而且樣品不需要預(yù)處理,測定過程非常方便。近年來,有諸多文獻(xiàn)報道利用核磁共振法進(jìn)行化合物的含量測定[8-11]。全志利等以苯甲醇為內(nèi)標(biāo)物,利用核磁共振氫譜測定天然氣中硫化氫含量；吳迪等利用19F 譜核磁共振技術(shù)建立吉非替尼含量的測定方法,為含氟藥物快速準(zhǔn)確的含量測定方法建立奠定了基礎(chǔ)。

本文旨在探索利用核磁共振技術(shù)建立PC的定性定量分析方法。工作中以新鮮蛋液為原料,以PC為研究對象,在以往卵磷脂提取方法的基礎(chǔ)上,采用乙醇(萃取)-丙酮(脫脂、重結(jié)晶)聯(lián)合提取法提取、純化蛋黃卵磷脂。

1 實驗

1.1 主要試劑、材料與儀器

試劑與材料:本實驗中所用全部試劑均為分析純及以上。電阻率為18 MΩ·cm的去離子水由純水系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)制得；市售鮮雞蛋、鮮鴨蛋及鮮鵪鶉蛋；無水乙醇、丙酮購自成都科龍試劑有限公司；氘代氯仿購自青島騰龍微波科技有限公司；磷脂酰膽堿(PC,純度>99%)、磷酸三苯脂(TPP,純度≥99.8%)購于阿拉丁試劑公司。

儀器:核磁共振儀(AVANCE III HD, 400 MHz, Bruker, Germany)；高速離心機(jī)(H-1850,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R-201,上海申順生物科技有限公司)。

1.2 蛋黃卵磷脂的提取

稱取一定量新鮮雞蛋黃、鴨蛋黃和鵪鶉蛋黃分別置于玻璃燒杯中,按蛋質(zhì)量與乙醇的體積比為1∶10,分別加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,常溫磁力攪拌60 min,8 000 r/min離心10 min,取上清液；沉淀再加入95%的乙醇浸提、離心,合并2次上清液；置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至近干,取出濃縮物,先用少量無水乙醇溶解然后加入丙酮重結(jié)晶純化,分離沉淀,真空干燥,得到淡黃色蠟狀卵磷脂,稱重。按如下公式(1)計算提取率：

提取率=(卵磷脂質(zhì)量/蛋黃質(zhì)量)×100%

(1)

1.3 樣品制備

1.3.1 內(nèi)標(biāo)物溶液的配制

稱取磷酸三苯酯25.0 mg,加入1.0 mL 氘代氯仿、配成25.0 g/L的儲備液待用。

1.3.2 PC標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取PC標(biāo)準(zhǔn)品,加入氘代氯仿配制質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 g/L溶液,分別加入內(nèi)標(biāo)物溶液0.1 mL,然后移至核磁管內(nèi)。

1.3.3 樣品溶液的配制

稱取提純的蛋黃卵磷脂樣品加入氘代氯仿配成一定濃度的樣品溶液并移至核磁管內(nèi)。

1.4 檢測方法

1.4.11H NMR測定

所謂典故，是指詩文中古代故事和有來歷出處的詞語。適當(dāng)運用典故可以增加文學(xué)表現(xiàn)力，在有限的詞語中展現(xiàn)更為豐富的內(nèi)涵；可以增加韻味和情趣，使文章委婉含蓄，避免平直。

氫譜分析條件：測定溫度為25 ℃,檢測頻率為400.13 MHz,譜寬為4 807.69 Hz,脈沖寬度為11.9 μs,采集時間6.82 s,延遲時間為2 s,采集次數(shù)為256次。

分別對配制好的PC標(biāo)準(zhǔn)溶液和提純樣品溶液進(jìn)行核磁氫譜測定。設(shè)置參數(shù)后測1H NMR譜圖。吸收峰準(zhǔn)確定標(biāo),調(diào)整峰相位,使峰形左右對稱,調(diào)整基線。對比磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品及提取樣品的核磁譜圖,分析雞蛋、鴨蛋和鵪鶉蛋蛋黃卵磷脂樣品的成分及純度。

1.4.231P NMR測定

磷譜分析條件:測定溫度為25 ℃,檢測頻率為161.97 MHz,譜寬為4 854.37 Hz,脈沖寬度為11.9 μs,采集時間為6.75 s,延遲時間為2 s,采集次數(shù)為200次。

分別對配制好的PC標(biāo)準(zhǔn)溶液和提純樣品溶液進(jìn)行核磁磷譜測定。設(shè)置參數(shù)后測31P NMR譜圖。吸收峰準(zhǔn)確定標(biāo),調(diào)整峰相位,使峰形左右對稱,調(diào)整基線。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、樣品PC含量及加標(biāo)回收實驗的測定

將配制好的質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 g/L的PC系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入0.100 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液,進(jìn)行31P NMR測定。對PC和內(nèi)標(biāo)物的特征峰的面積進(jìn)行積分,分別標(biāo)識為S1和S2。然后以樣品積分面積與內(nèi)標(biāo)物的積分面積比S1/S2為縱坐標(biāo),以樣品的濃度與內(nèi)標(biāo)物的濃度比C1/C2為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

然后往配制好的樣品溶液中加入0.100 mL 內(nèi)標(biāo)物溶液,同樣進(jìn)行31P NMR測定,對PC和內(nèi)標(biāo)物的特征峰的面積進(jìn)行積分,將S1/S2值代入線性回歸方程獲得樣品中PC濃度值。通過下式計算樣品中PC含量w：

w=C1V/m1

(2)

式中,C1為計算得的PC濃度,V為樣品體積,m1為稱取被測樣品的質(zhì)量。

根據(jù)樣品中測得PC含量分別加入一定量的PC標(biāo)準(zhǔn)品,然后測定31P NMR,對PC和內(nèi)標(biāo)物的特征峰的面積進(jìn)行積分,根據(jù)線性回歸方程計算樣品回收率值。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋黃卵磷脂提取率

傳統(tǒng)的卵磷脂制備方法都采用有機(jī)溶劑提取,其原理是根據(jù)不同物質(zhì)在同種溶劑中溶解度的不同而將卵磷脂與其他物質(zhì)分離。由于溶劑萃取法所得卵磷脂產(chǎn)品雜質(zhì)含量較高,因此,本工作采用乙醇(萃取)-丙酮(脫脂、重結(jié)晶)聯(lián)合提取法提取、純化蛋黃卵磷脂。將得到的固體真空干燥后稱量,按公式(1)計算提取率。實驗結(jié)果得到雞蛋、鴨蛋及鵪鶉蛋的蛋黃卵磷脂提取率分別為4.88、5.35、8.14 mg/g。

2.2 PC標(biāo)準(zhǔn)品和提取物的核磁共振氫譜比對

測定PC標(biāo)準(zhǔn)品和幾種鮮蛋蛋黃卵磷脂提純物的1H NMR,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明,PC標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)子峰主要出現(xiàn)在化學(xué)位移δ=3.2 ～ 5.4 ppm之間,3種鮮蛋蛋黃卵磷脂提純物的質(zhì)子峰也出現(xiàn)在該區(qū)域,且譜峰基本一致?？芍?采用該乙醇(萃取)-丙酮(脫脂、重結(jié)晶)聯(lián)合提取法所得蛋黃卵磷脂成份純度較高。

圖1 PC標(biāo)準(zhǔn)品和幾種蛋黃卵磷脂提純物在氘代氯仿中的1H NMR譜圖

2.3 內(nèi)標(biāo)物和溶劑的選擇

磷脂類化合物不溶于水,易溶于氯仿、甲醇等溶劑。擬選擇的內(nèi)標(biāo)物磷酸三苯酯不與分析物發(fā)生反應(yīng),且能與醇、氯仿、苯等混溶,而且氘代氯仿經(jīng)濟(jì)實惠,因此選擇氘代氯仿作為溶劑。內(nèi)標(biāo)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其31P NMR譜見圖2。

圖2 磷酸三苯酯在氘代氯仿中的31PNMR譜圖

由圖2可知,磷酸三苯酯分子只含有1個磷原子,因此只在δ=-17.71 ppm處出現(xiàn)1個尖銳的單峰,易于辨認(rèn),且此峰不會干擾待測樣品峰,能夠與樣品峰很好分離(見圖3)。此外，氘代氯仿不含磷,亦不會干擾內(nèi)標(biāo)物的譜峰。同時磷酸三苯酯具有價格低廉的優(yōu)點,可選作內(nèi)標(biāo)物。

圖3 PC與磷酸三苯酯在氘代氯仿中的31PNMR譜

2.4 定量峰的選擇

從圖3可以看出,內(nèi)標(biāo)物的特征峰與被測物的特征峰完全分離,對不同的物質(zhì)峰進(jìn)行歸屬,在化學(xué)位移δ=-0.99 ppm和δ=-17.71 ppm出現(xiàn)2個較大的尖銳峰,且無其他雜峰干擾。δ=17.71 ppm處信號為磷酸三苯酯的物質(zhì)峰,則δ=-0.99 ppm處為PC峰,峰形尖銳,易于積分定量分析,故選作定量峰。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

取質(zhì)量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 g/L的PC系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入0.100 mL內(nèi)標(biāo)物溶液,進(jìn)行31P NMR測定。對PC和內(nèi)標(biāo)物的特征峰的面積進(jìn)行積分,分別標(biāo)識為S1和S2，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

圖4 核磁共振磷譜測定PC的積分面積與濃度線性關(guān)系

圖4顯示,在PC質(zhì)量濃度為1.0～15.0 g/L的范圍內(nèi),S1/S2與C1/C2呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.653x-0.115,相關(guān)系數(shù)R2=0.991。表明以磷酸三苯酯為內(nèi)標(biāo)物,采用核磁共振磷譜法測定磷脂酰膽堿的含量是可行的。

2.6 樣品中磷脂酰膽堿含量以及加標(biāo)回收測定

取配制好的樣品溶液,加入0.100 mL內(nèi)標(biāo)物溶液,進(jìn)行31P NMR測定,得到的譜圖如圖5所示?？梢钥闯?物質(zhì)峰與內(nèi)標(biāo)物的峰能夠完全分離,根據(jù)前面所述,δ=-0.99 ppm處信號為PC峰。同時從圖5可知,除PC峰外,其附近還出現(xiàn)一小的雜質(zhì)峰,可能為其他磷脂類化合物,如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等[12]。

圖5 蛋黃樣品中提純PC與磷酸三苯酯在氘代氯仿中的31P-NMR譜

對PC和內(nèi)標(biāo)物的特征峰面積進(jìn)行積分,將S1/S2值代入線性回歸方程獲得樣品中PC的濃度值。通過公式(2)計算樣品中PC含量,結(jié)果如表1所示。同時進(jìn)行加標(biāo)回收實驗,表1中測定結(jié)果表明,此方法測定的PC含量的回收率在92% ～ 105% 之間,因此使用核磁共振磷譜內(nèi)標(biāo)法測定蛋黃中PC 含量有較好的準(zhǔn)確度。

表1 幾種鮮蛋蛋黃樣品的PC 質(zhì)量以及百分含量測定結(jié)果

3 結(jié)語

本文以新鮮蛋液為原料,以磷脂酰膽堿為研究對象,采用乙醇(萃取)-丙酮(脫脂、重結(jié)晶)聯(lián)合提取法提取、純化蛋黃卵磷脂；利用核磁共振技術(shù),以磷酸三苯酯為內(nèi)標(biāo)物,以化學(xué)位移δ=-0.99 ppm和δ=-17.71 ppm處的磷脂酰膽堿和磷酸三苯酯的單峰作為定量峰,得到其峰面積比與其濃度比線性回歸方程為y=0.653x-0.115,相關(guān)系數(shù)為R2=0.991,由此建立磷脂酰膽堿的核磁共振定性定量分析方法。采用料液比為1∶10、乙醇濃度為95%、提取時間為60 min的提取條件,不同種類蛋黃中卵磷脂提取量為4.88～8.14 mg/g；所研究的幾種蛋類其蛋黃中磷脂酰膽堿百分為16.9～27.4%,加標(biāo)回收實驗結(jié)果令人滿意,成功將核磁共振技術(shù)用于蛋黃中磷脂酰膽堿的分析測定。