豆雅楠 牛世全 豆建濤 趙 丹鄭豆豆 周 璇 王 彥 孔維寶 朱學泰

（西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070）

蘋果樹腐爛病是世界范圍內(nèi)危害蘋果樹最為嚴重的真菌性植物病害之一［1］，在我國主要蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，且危害嚴重。目前，對于蘋果樹腐爛病的研究已有一些進展：2014年，薛應鈺等［2］對甘肅省12個縣區(qū)23個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的74個蘋果園進行了蘋果樹腐爛病的發(fā)生和防治情況調(diào)查，結果表明在所調(diào)查的4 011株蘋果樹中，總體發(fā)病率為41.09%，慶城、鎮(zhèn)原和莊浪果園的果樹發(fā)病率較高，且鎮(zhèn)原果園的果樹發(fā)病最為嚴重，病情指數(shù)為42.18；臧睿等［3］研究了分離自陜西的61株蘋果樹腐爛病菌（Cytosporaspp.）的生物學特性及致病性，實驗結果表明，陜西省蘋果樹腐爛病菌具有多樣性、致病性分化現(xiàn)象和復雜性；王旭麗［4］通過對我國河北、河南、陜西、甘肅等9個省、23個市、縣的150個蘋果樹腐爛病分離株的形態(tài)學、培養(yǎng)性狀的觀察和對ITS序列的分析及人工條件下致病性試驗，明確了該病在我國的種類和優(yōu)勢類群，分析了蘋果樹腐爛病菌的遺傳分化規(guī)模，探討和比較了各病菌的表型差異和不同分離株在非自然條件下的致病性差異；孫廣宇［5］等研究了蘋果樹腐爛病發(fā)生程度與樹體營養(yǎng)之間的關系，以期為蘋果樹腐爛病的防治提供理論指導，結果表明樹體營養(yǎng)水平與蘋果樹腐爛病發(fā)生程度有明顯相關性。

甘肅省作為黃土高原蘋果生產(chǎn)的優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)，同時也是北方蘋果生產(chǎn)大省，蘋果產(chǎn)業(yè)已成為甘肅省的區(qū)域特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)和名副其實的農(nóng)民增收致富產(chǎn)業(yè)，發(fā)展?jié)摿薮螅?-7］。但近年來，隨著產(chǎn)業(yè)結構的調(diào)整和種植面積的擴大，蘋果樹腐爛病在各蘋果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，且有不斷蔓延之勢，已成為威脅我省蘋果產(chǎn)業(yè)安全健康和可持續(xù)發(fā)展的主要制約因素。該病主要發(fā)生在成齡的結果樹上，危害枝干皮層并引起腐爛癥狀，受侵染皮層產(chǎn)生紅褐色軟腐癥狀同時散發(fā)酒糟味。

為了明確甘肅省鎮(zhèn)原縣蘋果病區(qū)腐爛病的發(fā)病機理，采用病原菌分離和離體枝條接種法對甘肅省鎮(zhèn)原縣產(chǎn)區(qū)的蘋果樹腐爛病致病性進行檢測，結合形態(tài)學和分子生物學鑒定手段對該病病原菌種類及其分類地位做進一步確認，以期為進一步研究蘋果樹腐爛病的生物防治提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 供試材料 2016年4月采自甘肅省鎮(zhèn)原縣蘋果種植園有明顯腐爛癥狀的病枝。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用組織分離法［8］（圖1）。

圖1 病原菌的分離純化路線圖

1.2.2 致病性檢測 依據(jù)菌落形態(tài)特征，將初步鑒定的菌株用于回接致病性實驗。采用離體枝條接種法［9］（圖2），將 4℃冰箱中保存的菌株移至PDA活化后，制成菌餅用于后續(xù)實驗。

圖2 病原菌致病性檢測路線圖

1.2.3 病原菌培養(yǎng)性狀描述和形態(tài)鑒定 將初分離與再分離得到的菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基上，在28℃恒溫倒置培養(yǎng)5 d后，觀察菌落形態(tài)特征。待菌絲生長成熟后，顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)特征，參照相關資料［10］，進行分類學鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定 病原菌基因組DNA提取與rDNA-ITS區(qū)PCR擴增，將分離得到的菌株接種在PDB培養(yǎng)基中，28℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)3～4 d。離心沉淀，取菌絲體，加入TE緩沖液，煮沸法提取DNA。用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1和ITS4（表1）對rDNA-ITS區(qū)段進行PCR擴增。PCR反應體系（30 μL）：Taq DNA 聚合酶 15 μL，引物各1 μL，ddH2O 9 μL。 PCR 擴增程序如表2 所示。

表1 真菌通用引物及序列

表2 PCR擴增程序

病原菌rDNA-ITS序列測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構建，PCR擴增得到的產(chǎn)物送華大基因公司測序，測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫已知序列進行同源性比對分析，采用MEGA6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀特征 腐爛病主要危害枝干皮層引起腐爛癥狀，枝條染病后表現(xiàn)為病斑部位隆起，有酒糟味，發(fā)病后期病斑處失水干癟，下陷，之后病斑部位著生許多黑色小點為病菌的分生孢子器。

2.2 病原菌的初步分離和致病性檢測 對采自甘肅省鎮(zhèn)原縣蘋果產(chǎn)區(qū)3個采樣點的病原菌分離結果顯示：通過組織分離法分離到的菌株為同一菌株（圖3）；在PDA培養(yǎng)基上目標菌株的菌落呈雪花狀，菌背白色或深褐色，氣生菌絲稀少（圖4）。依據(jù)科赫法則采用離體枝條接種法將所分離菌株接種于健康枝條，觀察病斑產(chǎn)生情況，記錄病斑直徑，以只接種空白PDA菌餅且在觀測期內(nèi)未發(fā)病為對照，結果顯示：病原菌在接種10 d后病斑迅速擴展，病斑大小超出菌餅邊緣，病斑深褐色潰瘍狀，隨著時間的延長，病斑面積不斷擴大，直至侵染整個枝條（圖5）；重新分離枝條病組織部位的致病菌株，分離結果顯示該菌株重新分離的概率為100%。

圖3 病原菌分離結果

圖4 病原菌菌落形態(tài)

圖5 菌株P1離體枝條致病性測定結果

2.3 病原菌的鑒定 菌株P1顯微形態(tài)特征結果顯示菌落初為乳白色、后期為黃褐色，雪花狀、菌背白色或深褐色，氣生菌絲稀少。子囊孢子單細胞，無色，香蕉形，分生孢子單孢，無色，香蕉形。

通過對供試菌株的rDNA-ITS序列分析，其序列長度為594 bp（圖6），將供試菌株的序列通過BLAST與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中已知序列進行同源性比對，并用MEGA6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），結果顯示菌株P1與分離自新疆石河子蘋果樹皮的病原菌黑腐皮殼菌（V.mali）（KT934353）聚于同一分支。綜合顯微形態(tài)特征、菌落形態(tài)以及ITS基因序列分析結果，初步確認菌株P1為黑腐皮殼菌（V.mali）。

圖6 病原菌的DNA電泳圖

圖7 基于ITS基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

黑腐皮殼屬（valsa）屬于子囊菌門，它們大多為死體營養(yǎng)物，既能寄生、又能腐生，一般在寄主的葉、枝干、果上形成明顯的病斑，并在發(fā)病部位產(chǎn)生各種顏色的霉狀物或小黑點等特征［11］。其所致病害的種類較多，很多是重要的經(jīng)濟作物病害，可導致多種果樹的腐爛病。已有的研究結果顯示［9］子囊菌門蘋果黑腐皮殼菌的2個變種，即V.malivar.mali和V.malivar.pyri.是引起我國梨和蘋果腐爛病的主要病原菌；張旭業(yè)［12］等研究表明甘肅省蘋果樹腐爛病菌有2個種，分別為V.mali和Valsa malicola，其中V.mali有2個變種，分別為V.malivar.mali和V.malivar.pyri.Valsa leucostoma和Valsa cincta引起北美、歐洲的桃樹腐爛病，此外有研究結果顯示［13］，桃樹腐爛病菌除侵染桃樹外，還可侵染杏、油桐、櫻桃、花椒等。目前，對蘋果樹腐爛病致病菌的研究顯示，我國蘋果樹腐爛病的主要致病菌是V.mali［13-14］，與本研究結果一致。

依據(jù)不同的病害類型，植物病原菌的致病性檢測方法也因此而不同，而腐爛病致病菌測定多采用離體枝條接種法［15-16］，近些年也出現(xiàn)一些更為簡便的驗證方法，例如韋潔玲［17］、日本學者 Abe［18］等研究發(fā)現(xiàn)以嫩梢、完全展開葉作為接種材料，材料本身均一性較好，誤差小，鑒定結果穩(wěn)定，相比于離體枝條接種燙傷程度、深淺、面積難以保持一致和枝條燙傷時間長短、水含量不同等問題，其可作為快速、準確評價蘋果樹腐爛病菌致病性的方法。本實驗結合改進的離體枝條接種法對所分離到的菌株進行二次回接鑒定，以重新分離菌株與原菌株一致為原則，最終得到了甘肅省鎮(zhèn)原縣的1株蘋果樹腐爛病的致病菌株（P1），結合形態(tài)特性和產(chǎn)孢形態(tài)以及系統(tǒng)進化分析綜合得出菌株P1 為黑腐皮殼菌（V.mali）。

原有的對蘋果樹腐爛病致病菌的鑒定主要依據(jù)經(jīng)典分類學方法，由于目前尚無人對甘肅省鎮(zhèn)原縣蘋果產(chǎn)區(qū)蘋果樹腐爛病的病原菌種類組成和致病性問題進行系統(tǒng)研究且通過經(jīng)典的分類學方法對其鑒定具有一定的局限性和不確定性，而分子手段卻能彌補傳統(tǒng)分類學方法的不足和缺陷，其中真菌的ITS序列具有極為廣泛的序列多態(tài)性，常用于近緣物種的系統(tǒng)發(fā)育關系分析、菌種鑒定和種群遺傳分化研究，成為真菌鑒定的重要手段［19］。

目前針對蘋果樹腐爛病害已開展了一些生物防治工作，楊燕等［20］利用多羥基雙萘醛（Polyhydroxy dinaphthalde）提取物（WCT）研究了該植物源抗病毒復制抑制劑對蘋果樹腐爛病病原菌菌絲的生長抑制情況，以及對蘋果樹腐爛的防治效果，結果表明WCT對蘋果腐爛病菌具有一定的抑制作用和誘導寄主產(chǎn)生抗性的作用；王衛(wèi)雄等［21］從果園土壤和蘋果樹枝條上分離到2株細菌，該菌對蘋果樹腐爛病具有很好的拮抗作用，且離體枝條防效測定表明生防菌原液防效最高，分別為74.43%和 77.07%；薛應鈺等［22］從蘋果樹根際土壤中分離到一株對蘋果樹腐爛病具有很高抑制率的放線菌，離體枝條防效試驗表明，該菌發(fā)酵原液對蘋果樹腐爛病防效可達75%以上；張清明等［23］分離到了一株來自于健康蘋果樹枝條的拮抗放線菌卡伍爾鏈霉菌 （Streptomyces cavourensis）A-2，研究結果顯示其無菌發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病的抑制率高達95%以上。

本研究室長期從事極端環(huán)境資源微生物的相關研究，該生境下微生物易產(chǎn)生適應高鹽、高堿環(huán)境的特殊代謝產(chǎn)物和活性物質，形成特殊的生理機制，具有重要的應用價值。王蓓等［24］從甘肅省河西走廊鹽堿土中分離出較多對立枯絲核菌有較強生長抑制的生防放線菌，這些拮抗菌株對供試病原菌的生物防治有重要的應用價值；耿暉［25］等從河西走廊鹽堿土壤中分離篩選出一株對黃芪根腐病有強生防功能的放線菌株DA4-4-1，經(jīng)鑒定其為鏈霉菌屬藍紫鏈霉菌，為黃芪根腐病的田間生物防治提供新的手段。

目前本研究室正從敦煌地區(qū)鹽堿土壤中篩選獲得具有生防功能的芽孢桿菌，以期為蘋果樹腐爛病的生物防治提供新的手段。在植物病害中，70%～80%的病害是由病原真菌的侵染所致且部分病原真菌侵染農(nóng)作物時可分泌對人畜及環(huán)境有害的毒素和代謝物，對農(nóng)產(chǎn)品的安全性及生態(tài)環(huán)境構成極大威脅［26］，故本研究結果為后續(xù)蘋果樹腐爛病的生物防治工作提供了新的手段。