尹 蕾， 王偉舵， 陳子璇， 賁愛玲， 吳雨龍， 黃 和

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 211816； 2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 211171)

相關(guān)統(tǒng)計(jì)表明，全球每年約產(chǎn)出20億t的農(nóng)作物秸稈，而我國產(chǎn)秸稈數(shù)量高達(dá)9億t，占全世界范圍內(nèi)秸稈產(chǎn)量的20%～30%[1]。水稻秸稈主要是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、粗蛋白、低分子碳水化合物及無機(jī)鹽等構(gòu)成的[2]。秸稈中含有多種化學(xué)微量元素，其中硅是含量最多的礦物元素[3]。水稻秸稈中纖維素和半纖維素含量相當(dāng)，均在30%左右，兩者是維持水稻秸稈形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要物質(zhì)，木質(zhì)素含量較低，僅為4%，粗蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白含量分別為5%、4%，硅化物含量為9%[4]。細(xì)菌、真菌、放線菌主要負(fù)責(zé)分解秸稈中的纖維素與半纖維素，部分細(xì)菌和真菌也可用于分解木質(zhì)素[5]。可以降解纖維素的真菌種類較多，分解能力較強(qiáng)的真菌主要分為木霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬。木質(zhì)素可以被黃單胞菌、假單胞菌、不動桿菌等菌種分解，一般情況下真菌的分解能力比細(xì)菌強(qiáng)得多[6]。

本研究主要篩選高效降解秸稈纖維素的微生物菌株。通過土壤微生物的富集與分離，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)單一碳源篩選，羧甲基纖維素(簡稱CMC)酶活性和濾紙酶活性的測定，篩選獲得高產(chǎn)纖維素菌株，并采用改進(jìn)的Van Soest洗滌法測定供試菌株處理后水稻秸稈的失質(zhì)量率與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量[7]。從菌株對秸稈進(jìn)行降解的培養(yǎng)基中提取有機(jī)物質(zhì)，其中包括微生物分泌出的具有揮發(fā)性的有機(jī)化合物及其降解秸稈所產(chǎn)生的不同有機(jī)產(chǎn)物，探討枝孢菌BD-19的秸稈生物降解能力，為秸稈高效降解提供菌種資源和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年9月至2016年9月在南京曉莊學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.1 材料與儀器

供試土樣：試驗(yàn)土樣取自南京市江寧區(qū)稻麥輪作農(nóng)田，共50份。

主要儀器有7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，簡稱GC-MS)，由美國Agilent公司提供。

主要供試藥品與試劑有：A，3，5-二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylic acid，簡稱DNS)試劑，稱量6.3 g DNS，加少量蒸餾水溶解后加入262 mL 2 mol/L NaOH溶液；B，稱取 185 mg 酒石酸鉀納，加500 mL蒸餾水加熱溶解?；旌螦、B后，加入5 g結(jié)晶苯酚和亞硫酸鈉，冷卻后，加入蒸餾水至 1 000 mL，用棕色磨砂廣口瓶儲存，保存1周后再使用。

0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH值= 4.5)：取271.2 mL溶液A，與228.8 mL溶液B混合，加入蒸餾水至 1 000 mL。

0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH值=5.0)：取205 mL溶液A、295 mL溶液B混勻后，向其中加入蒸餾水定容至 1 000 mL，即得。溶液A(0.1 mol/L檸檬酸)：21 g C6H8O7·H2O，加蒸餾水至1 000 mL。溶液B(0.1 mol/L檸檬酸鈉)：稱取29.4 g Na3C6H5O7·2H2O，加入蒸餾水定容至 1 000 mL。

0.51% CMC-Na溶液：稱取5.1 g CMC-Na，加入少量蒸餾水后加熱溶解，向其中加入5 mL pH值為5.0的檸檬酸緩沖液后混合均勻，并加蒸餾水定容至 1 000 mL。

中性洗滌劑。A：稱取18.6 g乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，簡稱EDTA)、6.8 g 硼酸鈉，加入少量蒸餾水后，適當(dāng)加熱溶解。B：30 g十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)、10 mL乙二醇乙醚、4.56 g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，加少量蒸餾水并加熱溶解。將A、B混勻后加蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0左右。

2.0 mol/L鹽酸溶液：量取800 mL 蒸餾水于1 L容量瓶中，加入密度為1.19 g/mL的濃鹽酸167 mL，加入蒸餾水定容至刻度。

72%硫酸溶液：取300 mL蒸餾水于1 L容量瓶中，緩慢加入密度為1.84 g/mL的濃硫酸665 mL，待冷卻至室溫后，加蒸餾水定容至刻度。

DNA提取液：將2.42 g Tris(三羥甲基氨基甲烷)、2.92 g NaCl、0.372 g EDTA-Na、1 g SDS溶于100 mL 去離子水中，將pH值調(diào)至8.0。

主要培養(yǎng)基有：(1)LB固體培養(yǎng)基。5 g酵母提取物、10 g 蛋白胨、5 g NaCl、15～20 g瓊脂，1 000 mL超純水，pH值為7.4。不添加瓊脂的為LB液體培養(yǎng)基。(2)PDA培養(yǎng)基。稱取200 g馬鈴薯切成小塊，煮沸20～30 min，加20 g蔗糖、16 g瓊脂粉，用純水定容至1 000 mL，pH值為7.4。不添加瓊脂粉的為PDA液體培養(yǎng)基。(3)羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基。0.5 g NH4NO3、0.5 g MgSO4·7H2O、1 g酵母提取物、15 g CMC-Na，用純水定容至1 000 mL。(4)赫奇遜氏無機(jī)鹽培養(yǎng)基。1.0 g KH2PO4、0.1 g NaCl、0.3 g MgSO4·7H2O、2.5 g NaNO3、0.01 g FeCl3、0.1 g CaCl2，用去離子水定容至 1 000 mL，pH值為7.2 。(5)秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)基。取1.0 g經(jīng)NaOH溶液浸泡并水洗至中性的秸稈于三角瓶中，再加入100 mL赫奇遜氏無機(jī)鹽培養(yǎng)基。(6)秸稈粉末培養(yǎng)基。取經(jīng)NaOH溶液浸泡并水洗至中性的秸稈于干燥箱，于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎過60目篩，于培養(yǎng)皿中加入5 g秸稈粉和 25 mL 混合溶液[0.5 g/L NaCl 、0.5 g/L MgSO4、3 g/L(NH4)2SO4、1 g/L KH2PO4、0.3 g/L CaCl2、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.015 g/L MnSO4·7H2O 、0.015 g/L ZnSO4·7H2O 、0.01 g/L CoCl2]，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 秸稈降解菌的初步篩選 稱取5.0 g稻麥輪作農(nóng)田土樣，倒入含有45 mL無菌水的三角瓶中，在溫度為28 ℃的條件下?lián)u床振蕩30 min后取出，為10-1濃度，用無菌水分別稀釋至10-5、10-6、10-7等3個(gè)濃度梯度用于涂布，分別涂布于LB培養(yǎng)基、PDA無菌平板，放置于溫度為28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。將得到的單菌落進(jìn)行分離純化。將上述分離得到的單菌落搖瓶發(fā)酵菌液接種至CMC-Na平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)2～3 d，觀察平板上水解圈并比較其大小，選取水解圈較大、較明顯的菌株。

1.2.2 纖維素酶活性測定

1.2.2.1 纖維素酶活性的測定 纖維素的酶活性主要由濾紙酶活性和內(nèi)切酶活性表示。用DNS法測定還原糖含量，反應(yīng)底物為非淀粉新華濾紙和羧甲基纖維素鈉(CMC鈉)，酶活性單位定義：1 mL酶溶液在溫度為50 ℃、pH值為4.8條件下，1 min水解底物生成1.0 μmoL葡萄糖的量為1個(gè)酶單位(U)。

1.2.2.2 濾紙酶活性(FPA)的測定 在5支試管中加入 0.5 mL 酶溶液和濃度為0.05 mol/L、pH值為4.5的檸檬酸緩沖液，并向?qū)φ赵嚬苤屑尤?.5 mL DNS，放在50 ℃水浴鍋中預(yù)熱5～10 min，各加入1.0 cm×6.0 cm無淀粉新華濾紙條，在溫度為50 ℃條件下保溫60 min，取出后立刻向非對照試管中加入1.5 mL DNS停止反應(yīng)。在540 nm處記錄測定的其他各試管的D540 nm。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出相應(yīng)的葡萄糖含量，并計(jì)算出相應(yīng)的濾紙酶活性。

1.2.2.3 內(nèi)切酶活性的測定 在5支試管中加入0.5 mL粗酶液和1.0 mL 0.51% CMC-Na溶液，方法同濾紙酶活性測定。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的葡萄糖含量，并計(jì)算出其對應(yīng)的內(nèi)切酶活性。

1.2.3 秸稈液態(tài)發(fā)酵降解能力測定 將初步篩選出的菌株在PDA平板上培養(yǎng)，待其長滿平板時(shí)于超凈工作臺中用涂布器及無菌水沖洗出菌絲及孢子，將其全部轉(zhuǎn)入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min條件下于搖床振蕩培養(yǎng)10 d后取出。秸稈失質(zhì)量率的測定采用差質(zhì)量法，通過改進(jìn)的Van Soest方法測定樣品中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率。

1.2.4 高效秸稈降解菌DNA的ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))鑒定 從篩選出的菌株中，選取酶活性及降解效果均較為突出的菌株進(jìn)行鑒定。將菌株在PDA培養(yǎng)基上于溫度為25 ℃的條件下培養(yǎng)5 d，轉(zhuǎn)接到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7 d，收集子實(shí)體，提取DNA。以提取菌株的DNA為模板，分別以ITS1、ITS5為引物來PCR擴(kuò)增ITS序列。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后送到南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。供試菌株的ITS測序拼接序列與NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)中Blast數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，并利用MEGA4.1軟件構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.5 菌株降解秸稈產(chǎn)物測定 先進(jìn)行菌株接種，菌株接種3 d后可進(jìn)行菌絲取樣，分別于接種3、5、10、20、30 d時(shí)取菌絲和培養(yǎng)基作為待分析樣品。衍生化反應(yīng)后，每個(gè)樣品用于GC-MS分析后丟棄。利用AMDIS軟件(NIST，v2.69，Gaithersburg，MD，USA)和MSD Chemstation軟件(G1701 EAE.02.00.493，美國安捷倫科技有限公司)進(jìn)行質(zhì)譜峰的定性分析。將代謝物的質(zhì)譜圖中質(zhì)量碎片峰位置和信息與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而對色譜圖中的各個(gè)峰數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所用譜庫主要是NIST2005、Wiley。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

將來自稻麥輪作農(nóng)田的土樣在LB和PDA固體培養(yǎng)基中進(jìn)行分離與純化，共得到163株細(xì)菌，18株真菌。選用剛果紅染色法和CMC-Na水解圈測定試驗(yàn)，根據(jù)得到的菌株菌落直徑(d，cm)和水解圈直徑(D，cm)，可得水解能力Dp，相關(guān)公式：Dp=(D/d)2，由此選出15株真菌。

2.2 纖維素酶活性的測定

纖維素的降解是多種酶體系共同作用的結(jié)果，本試驗(yàn)主要測定供試菌株的CMC酶活性以及濾紙酶活性，作為菌株復(fù)篩的依據(jù)。通過液體發(fā)酵方式，篩選得到酶活性較高的12株真菌。將試驗(yàn)真菌添加到PDA液體培養(yǎng)基中，在溫度為 25 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng) 72 h 后測定其酶活性，結(jié)果如表1所示。

2.3 秸稈液態(tài)發(fā)酵降解能力的測定

采用液態(tài)發(fā)酵的方式研究以上試驗(yàn)得到的12株真菌。以改進(jìn)的Van Soest洗滌法測定供試菌株對水稻秸稈中半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解效果。

在液態(tài)培養(yǎng)條件下，經(jīng)各菌株處理，其中BD-19菌株處理后的降解效果與其他菌株相比明顯較好，其秸稈的失質(zhì)量率達(dá)到44.51%，半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解率分別為16.64%、26.42%、11.43%(表2)。

2.4 高效秸稈降解菌的鑒定

如圖1所示，將真菌BD-19的ITS測序拼接序列與NCBI中Blast數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，BD-19與枝孢屬菌(Cladosporiumsp.)EU-375523的ITS序列同源性為99%[8]，結(jié)合供試菌株的菌落形態(tài)特征，可初步將其鑒定為Cladosporiumsp. BD-19。

表1 不同菌株的酶活性測定結(jié)果

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下表同。

表2 秸稈降解后各組分含量變化

2.5 菌株降解秸稈產(chǎn)物的測定

將枝孢菌BD-19接種到秸稈粉末液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，分別于3、5、10、20、30 d采樣，進(jìn)行降解秸稈所得產(chǎn)物的GC-MS測定，測定結(jié)果見圖2至圖6。

在降解過程中，檢測到有機(jī)化合物如烷、醇、酚、羧酸、硅氧烷、鹵代烴等。醇、酚、羧酸、硅氧烷等物質(zhì)表明木質(zhì)纖維素得到有效降解[9]。由表3可知，接種3 d獲得6種降解物，5 d后獲得13種降解物，10 d后獲得17種降解物，20 d后獲得5種產(chǎn)物，30 d后獲得3種產(chǎn)物?？煽闯鼍暝?0 d之前降解所得有機(jī)產(chǎn)物逐漸增多，在10 d之后降解所得產(chǎn)物明顯減少。其中，以接種10 d所得降解產(chǎn)物最多。

半纖維素是不同類型單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體， 主要由包括木糖、阿拉伯糖、半乳糖等的五碳糖、六碳糖構(gòu)成[10]。構(gòu)成半纖維素的糖基主要有D-木糖基、D-甘露糖基、D-葡萄糖基、D-半乳糖基、L-阿拉伯糖基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸基、D-半乳糖醛酸基、D-葡萄糖醛酸基等[11]。由表3可知，在接種3 d產(chǎn)物中有D-甘露酸；接種5 d產(chǎn)物中有葡萄糖醇；接種10 d產(chǎn)物中有D-果糖、半乳糖；接種20 d的產(chǎn)物中有葡萄糖酸；接種30 d產(chǎn)物中含有葡萄糖醇和葡萄糖酸。由此可知，本試驗(yàn)所用的枝孢菌BD-19菌株對秸稈中的半纖維素中所含的糖基類物質(zhì)有降解作用。

表3 枝孢菌BD-19在不同時(shí)間降解秸稈的代謝產(chǎn)物

半纖維素主要分為3類，即聚木糖類、聚葡萄甘露糖類、聚半乳糖葡萄甘露糖類，其中聚木糖類主要是以1，4-β-D- 吡喃型木糖構(gòu)成主鏈，以4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸為支鏈的多糖，其主要由β-D-吡喃型木糖基、4-氧甲基-吡喃型葡萄糖醛酸基、α-L-呋喃型阿拉伯糖構(gòu)成[12]。由表3可知，在菌株降解秸稈的5 d生成了D-戊二酸呋喃糖、阿拉伯吡喃糖，由此說明，枝孢菌BD-19對半纖維素中的聚木糖有降解作用。

構(gòu)成半纖維素的3種糖類中的聚葡萄甘露糖是由D-吡喃型葡萄糖基、呋喃型甘露糖基以1，4-β型連接成主鏈[13]。另一類聚半乳糖葡萄糖甘露糖還有D-呋喃型半乳糖基用支鏈形式以1，6-α型連接到此主鏈上的若干D-呋喃型半乳糖基、D-吡喃型葡萄糖基上[14]，由表3可知，在菌株降解秸稈的3 d，產(chǎn)物中有D-甘露酸出現(xiàn)；在5 d時(shí)，產(chǎn)物中有葡萄糖醇出現(xiàn)；30 d時(shí)，產(chǎn)物中有葡萄糖醇、葡萄糖酸。由此可知，枝孢菌BD-19對半纖維素中的聚葡萄甘露糖具有一定的降解作用。

分析表3中物質(zhì)結(jié)構(gòu)可以看出，接種3 d時(shí)碳原子數(shù)在20個(gè)以上的物質(zhì)有2種，5 d時(shí)有3種，10 d時(shí)有4種，20 d時(shí)沒有碳原子數(shù)在20個(gè)以上的物質(zhì)，30 d時(shí)有1種。由此可見，碳鏈在10 d后有明顯的斷裂，初步推斷，枝孢菌BD-19在10 d左右對秸稈的降解作用較為明顯。

計(jì)算表3中物質(zhì)的分子量可知，接種3 d時(shí)物質(zhì)的分子量為 220～467；5 d物質(zhì)的分子量為225～467；10 d時(shí)物質(zhì)的分子量為153～461；20 d時(shí)物質(zhì)的分子量為234～338；30 d時(shí)物質(zhì)的分子量為231～338。由此可見，枝孢菌 BD-19在10 d后對秸稈的降解作用較明顯。

枝孢菌BD-19接種后5～7 d菌落生長最旺盛，之后菌落直徑不再擴(kuò)大，在其生長期間，由于該菌細(xì)胞內(nèi)纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等沒有大量產(chǎn)生，所以在3～5 d 時(shí)枝孢菌BD-19可能對秸稈降解的速度較慢，因而所得產(chǎn)物較少；在5～10 d時(shí)推測，枝孢菌BD-19能產(chǎn)出較多的纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等，從而提高了菌株對秸稈的降解速率。

在菌株生長的后期，隨著秸稈培養(yǎng)基中提供的糖類、碳源、氮源、無機(jī)鹽等菌株生長所必需的物質(zhì)逐漸減少，影響了菌株的正常生長以及現(xiàn)有菌株的活性，從而導(dǎo)致3種纖維素、木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生量越來越少。與本研究所顯示的結(jié)果一致，在菌株生長平穩(wěn)期過后的衰亡期，有機(jī)物含量越來越少。

3 結(jié)論與討論

本研究主要從稻麥輪作農(nóng)田土樣中以稀釋涂平板的方法分離出各菌株，并進(jìn)行純化。選用剛果紅染色法以及CMC-Na水解圈測定法，將所得菌株進(jìn)行初次篩選后得到具有秸稈降解能力的15株真菌。測定這些菌株的CMC及FPA酶活性后，進(jìn)一步得到酶活性較高的12株真菌。

在液態(tài)發(fā)酵條件下，將秸稈作為唯一碳源的培養(yǎng)基于搖床振蕩培養(yǎng)10 d后，秸稈的形態(tài)明顯發(fā)生了變化，以差質(zhì)量法測定其失質(zhì)量率與半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解率。其中，真菌BD-19降解秸稈的失質(zhì)量率達(dá)到44.51%，半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解率分別為16.64%、26.42%、11.43%。BD-19菌株經(jīng)過形態(tài)特征及ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定其屬于枝孢菌屬。

利用GC-MS對篩選出的高效降解秸稈菌株BD-19降解秸稈的能力進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過對其降解秸稈產(chǎn)生有機(jī)物的分析表明，產(chǎn)物中除了含有少量烷烴類物質(zhì)外，還含有32種有機(jī)物，從有機(jī)物的種類及含量變化上可以判斷，枝孢菌BD-19對纖維素、木質(zhì)素均有降解作用。