王洪濤， 王英姿， 石 潔， 董泰麗， 付傳翠

(1.山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所，山東煙臺(tái) 265500； 2.山東民和生物科技股份有限公司，山東蓬萊 265600)

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)面臨著能源短缺和環(huán)境污染的兩大問(wèn)題。沼氣工程具有可以產(chǎn)生替代能源和減少環(huán)境污染的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)規(guī)?；託夤こ探ㄔO(shè)在國(guó)內(nèi)外得到了迅速發(fā)展[1-3]。沼液是沼氣生產(chǎn)的重要副產(chǎn)品，是一種養(yǎng)分含量全面、速效養(yǎng)分豐富、肥效穩(wěn)定的有機(jī)肥。將其有效利用，不僅可以帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益，而且具有顯著的社會(huì)效益[4]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)沼液的綜合利用進(jìn)行了很多研究，主要集中于沼液作為有機(jī)肥在農(nóng)業(yè)生態(tài)中的應(yīng)用，包括對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、品質(zhì)的影響，對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響，對(duì)環(huán)境的安全評(píng)價(jià)等[5-7]。

沼液除了具有肥力特性外，還具有抑菌、抗逆、殺死和抑制作物病蟲(chóng)的作用，是理想的化學(xué)農(nóng)藥代替品[8]。前人關(guān)于沼液施用對(duì)作物病害防治的作用開(kāi)展了大量研究，主要集中于水稻、小麥、玉米、棉花、煙草、甘薯、番茄、辣椒、黃瓜、茄、草莓等作物上。已有研究表明，沼液對(duì)某些植物病原真菌具有顯著抑制作用[9-10]，但關(guān)于雞糞沼液對(duì)果樹(shù)類病原菌抑制作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究選擇對(duì)果樹(shù)(蘋(píng)果、葡萄)有較大影響的5種主要病原菌(蘋(píng)果輪紋病病菌、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病菌、葡萄灰霉病病菌、葡萄白腐病病菌、葡萄炭疽病病菌)進(jìn)行雞糞沼液抑菌和殺菌試驗(yàn)，分別研究不同濃度的雞糞沼液對(duì)這5種病原真菌的抑制效果和滅殺作用，旨在為進(jìn)一步研究雞糞沼液抑制病原菌機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為雞糞沼液應(yīng)用于果樹(shù)病害的田間防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沼液 沼液由山東民和生物科技股份有限公司提供，主要發(fā)酵原料為雞糞。

1.1.2 菌種 蘋(píng)果輪紋病病菌(Botryosphaeriadothidea)、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病菌(Alternariamali)、葡萄白腐病病菌(Coniothyriumdiplodiella)、葡萄炭疽病病菌(Glomerellacingulata)、葡萄灰霉病病菌(Botrytiscinerea)由山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 上述5種病菌菌試驗(yàn)均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，簡(jiǎn)稱PDA)培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)前的準(zhǔn)備 雞糞沼液濃度梯度的設(shè)定：將雞糞沼液用無(wú)菌水稀釋成5、10、25、50、100、300倍液6個(gè)濃度梯度，備用。

供試病原菌的培養(yǎng)：將已接種供試菌的PDA培養(yǎng)基平皿放入恒溫箱培養(yǎng)4～5 d，備用。

1.2.2 抑菌試驗(yàn)操作 將培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌20 min，自然冷卻至溫度為30～40 ℃時(shí)，按照每100 mL PDA培養(yǎng)基中添加5 mL的比例，分別向盛有培養(yǎng)基的三角燒瓶中加入不同濃度的雞糞沼液，以無(wú)菌水作為對(duì)照，混合均勻后倒入平皿中。待平皿中培養(yǎng)基凝固后，在無(wú)菌條件下，用滅過(guò)菌的內(nèi)徑為 6 mm 的打孔器取相同大小的菌餅。將菌餅移至不同培養(yǎng)基平皿中央，菌絲面朝下(菌絲面與培養(yǎng)基接觸)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置1個(gè)菌餅。將接菌后的培養(yǎng)皿置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度為27 ℃的條件下培養(yǎng)。共培養(yǎng)7 d，每隔24 h用游標(biāo)卡尺十字交叉法垂直測(cè)量培養(yǎng)基平皿上病原菌菌落的直徑，取其平均值，單位為mm，記數(shù)。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.3 殺菌試驗(yàn)操作 在無(wú)菌條件下，用滅過(guò)菌的內(nèi)徑為 6 mm 的打孔器將完全被抑制的菌塊(雞糞沼液5倍液處理)移至空白PDA培養(yǎng)基平皿中央。將平皿放入恒溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h測(cè)量培養(yǎng)基平皿中病原菌菌落的直徑，記數(shù)，共培養(yǎng) 7 d。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.4 抑(殺)菌率計(jì)算公式 根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，按下面公式計(jì)算抑(殺)菌率：

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 18.0分析軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞糞沼液對(duì)葡萄灰霉病病菌的抑制效果

由表1可知，雞糞沼液對(duì)葡萄灰霉病病原菌生長(zhǎng)抑制作用明顯，且與其濃度呈正相關(guān)。試驗(yàn)期間，5、10倍液雞糞沼液處理對(duì)葡萄灰霉病病菌抑制率均為100.00%。處理1 d后，25、50、100倍液雞糞沼液處理對(duì)葡萄灰霉病病菌抑制率分別為100.00%、100.00%、91.67%；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑菌效果略有下降，7 d后抑菌率分別為92.62%、83.07%、61.46%。300倍液雞糞沼液處理對(duì)葡萄灰霉病病菌抑制率較差，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)抑菌率僅為11.33%。

2.2 雞糞沼液對(duì)葡萄白腐病的抑制效果

由表2可知，沼液濃度不同，其對(duì)葡萄白腐病的抑制作用有一定差異。5、10倍液雞糞沼液處理對(duì)葡萄白腐病病菌抑制率均為100.00%。處理1 d后，25、50、100倍液雞糞沼液處理對(duì)葡萄白腐病菌抑制率分別為100.00%、100.00%、89.29%；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑菌效果略有下降，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)抑菌率分別為90.68%、85.04%、58.35%。處理后7 d，300倍液雞糞沼液處理對(duì)葡萄白腐病病抑菌率僅為13.66%，抑制效果較差。

表1 雞糞沼液對(duì)葡萄灰霉病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

表2 雞糞沼液對(duì)葡萄白腐病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

2.3 雞糞沼液對(duì)葡萄炭疽病的抑制效果

由表3可知，雞糞沼液對(duì)葡萄炭疽病病菌抑菌作用差異明顯，且與其濃度密切相關(guān)。其中，5、10倍液雞糞沼液處理抑菌作用最為明顯，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)葡萄炭疽病病原菌生長(zhǎng)的抑制率分別為100.00%、78.15%，其他4個(gè)處理對(duì)葡萄炭疽病病菌抑菌率均在29.00%以下，抑菌效果不顯著。

表3 雞糞沼液對(duì)葡萄炭疽病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

2.4 雞糞沼液對(duì)蘋(píng)果輪紋病的抑制效果

由表4可知，雞糞沼液對(duì)蘋(píng)果輪紋病病菌抑菌作用隨著沼液濃度的降低而逐漸減弱。其中，5、10倍液雞糞沼液處理抑菌作用最為明顯，試驗(yàn)停止時(shí)對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原菌生長(zhǎng)的抑制率分別為100.00%、86.78%，其他4個(gè)處理對(duì)蘋(píng)果輪紋病病菌抑菌率均在26.00%以下，抑制作用不明顯或無(wú)抑制作用。

2.5 雞糞沼液對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病的抑制效果

由表5可知，不同濃度的雞糞沼液對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病原菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。其中，5倍雞糞沼液稀釋液處理抑菌作用最為明顯，抑菌率均為100.00%；處理 7 d 后， 10、25、50 倍液雞糞沼液稀釋液 3個(gè)處理抑菌率均在46%以下，抑制效果不明顯；100、300倍液雞糞沼液稀釋液2個(gè)處理對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病菌抑菌率為負(fù)值，說(shuō)明這2個(gè)處理對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病沒(méi)有抑制作用。

表4 雞糞沼液對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

表5 雞糞沼液對(duì)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用

2.6 雞糞沼液對(duì)5種果樹(shù)病原菌的滅殺作用

病原菌不同，雞糞沼液對(duì)其滅殺作用存在差異。由表6可知，雞糞沼液稀釋5倍后對(duì)葡萄灰霉病病菌、蘋(píng)果輪紋病病菌、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病菌的生長(zhǎng)都表現(xiàn)出極強(qiáng)的滅殺作用，7 d 試驗(yàn)中，滅菌率均為100.00%，但對(duì)葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌滅殺作用稍差。處理1、2 d后，其對(duì)葡萄炭疽病病菌滅殺率均為100.00%，對(duì)葡萄白腐病病菌滅殺率分別為63.70%、44.09%，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其滅菌效果逐漸減弱。至7 d時(shí)，雞糞沼液5倍稀釋液對(duì)葡萄炭疽病病菌和葡萄白腐病病菌滅菌率分別為45.29%、30.35%。

表6 雞糞沼液對(duì)5種果樹(shù)病原菌生長(zhǎng)的滅殺作用

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。

3 討論

沼液對(duì)許多植物病原真菌具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用[8，10-12]，但相關(guān)研究主要集中在以豬糞、牛糞為發(fā)酵原料的沼液上。由于沼液的成分受發(fā)酵原料、沼氣工程等工藝等因素的影響，不同沼液的理化及生物學(xué)性狀有很大差異，因此沼液對(duì)植物病害的防治效果并不完全一致[13]。

本研究以5種常見(jiàn)果樹(shù)病原菌為防治對(duì)象，分析以雞糞為發(fā)酵原料的沼液對(duì)這5種病原菌生長(zhǎng)的抑制效果和滅殺作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，雞糞沼液對(duì)這5種病原菌的抑制效果與其濃度有關(guān)。雞糞沼液稀釋5倍后，均能完全抑制各種病原菌的生長(zhǎng)。隨著沼液濃度的降低，其抑菌作用逐漸減弱。在同一濃度下，雞糞沼液對(duì)葡萄灰霉病和葡萄白腐病具有明顯的抑制作用，但對(duì)葡萄炭疽病、蘋(píng)果輪紋病和蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病的抑制效果較弱，說(shuō)明同一沼液對(duì)不同病原菌的抑制作用存在差異，這與馬艷等的研究結(jié)論[14-15]一致。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，雞糞沼液對(duì)5種果樹(shù)病原菌的抑菌作用逐漸減弱，這與尚斌等研究結(jié)果[13]矛盾，這可能與沼液發(fā)酵原料和病原菌種類不同有關(guān)。國(guó)內(nèi)關(guān)于沼液在植物病害防治上的應(yīng)用已有諸多報(bào)道，但主要集中在沼液對(duì)植物病原菌生長(zhǎng)的抑制作用，并未對(duì)其殺菌作用進(jìn)行深入研究。雞糞沼液對(duì)5種果樹(shù)病原菌殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，雞糞沼液對(duì)葡萄灰霉病病菌、蘋(píng)果輪紋病病菌、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病菌的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出極強(qiáng)的滅殺作用，滅菌率均為100%，但對(duì)葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌滅殺作用稍差，這說(shuō)明雞糞沼液對(duì)不同病原菌的滅菌效果有所不同。

葡萄灰霉病、葡萄白腐病、葡萄炭疽病、蘋(píng)果輪紋病、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病是葡萄、蘋(píng)果等果樹(shù)生產(chǎn)中的重要病害[16-19]，對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大[20-22]。目前對(duì)上述病害的防治仍以化學(xué)防治為主，但由于用藥不科學(xué)，多年持續(xù)使用單一藥劑，造成病原菌對(duì)一些殺菌劑已產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[23-26]。因此，亟須應(yīng)用無(wú)公害技術(shù)防治上述病害。沼液因無(wú)污染、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性而被人們稱為“生物農(nóng)藥”，其用于植物病蟲(chóng)害防治的研究已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。已有研究結(jié)果表明，用沼液替代化肥和農(nóng)藥，可減少20%以上的化肥和農(nóng)藥施用量，并顯著降低某些病害的發(fā)生率[9]。本試驗(yàn)所用雞糞沼液已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，具有生產(chǎn)全流程自控、產(chǎn)品全生態(tài)性、沼液養(yǎng)分穩(wěn)定等工藝優(yōu)勢(shì)，克服了傳統(tǒng)沼液對(duì)病害防治效果不穩(wěn)定、重復(fù)性差的缺點(diǎn)。雞糞沼液稀釋50倍后對(duì)葡萄灰霉病、葡萄白腐病的抑制效果仍在80%以上，作為生物制劑其抑菌效果與部分化學(xué)農(nóng)藥相當(dāng)，下一步將在田間驗(yàn)證其對(duì)果樹(shù)病害的防治效果，并探索雞糞沼液與化學(xué)農(nóng)藥混和使用在果樹(shù)病害防治方面的可行性。

目前關(guān)于沼液抑菌防病效果的研究仍處于探索階段，本試驗(yàn)在室內(nèi)研究雞糞沼液對(duì)5種果樹(shù)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用和滅殺效果，下一步將深入研究其對(duì)病原菌產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)的影響。雞糞沼液對(duì)病原菌的抑制作用與其濃度密切相關(guān)，今后將進(jìn)一步分析沼液中主要抑菌、滅菌成分，更好地了解雞糞沼液抗病作用機(jī)制。

雞糞沼液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制作用具有選擇性，且與其濃度呈正相關(guān)。雞糞沼液對(duì)葡萄灰霉病和葡萄白腐病具有強(qiáng)烈的抑制作用，但對(duì)葡萄炭疽病、蘋(píng)果輪紋病和蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病的抑制作用不明顯；隨著雞糞沼液濃度的降低，其對(duì)病原菌的抑制作用逐漸減弱。雞糞沼液對(duì)不同病原菌的滅殺效果存在差異，雞糞沼液稀釋5倍后能夠完全滅殺葡萄灰霉病病菌、蘋(píng)果輪紋病病菌、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病病菌，但對(duì)葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌滅殺作用稍差。在田間對(duì)葡萄灰霉病、葡萄白腐病的防治推薦使用雞糞沼液50倍液，對(duì)其他3種病害的防治建議使用雞糞沼液10倍液。雞糞沼液對(duì)同一種病原菌的抑制作用和滅殺活性是不同的。雞糞沼液能夠完全抑制葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌的生長(zhǎng)，但并不能將這2種病原菌全部殺死。研究結(jié)果可為雞糞沼液用于果樹(shù)病害環(huán)境友好型殺菌劑的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供科學(xué)參考。