王洪濤， 王英姿， 石 潔， 董泰麗， 付傳翠

(1.山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護研究所，山東煙臺 265500； 2.山東民和生物科技股份有限公司，山東蓬萊 265600)

進入21世紀以來，我國面臨著能源短缺和環(huán)境污染的兩大問題。沼氣工程具有可以產(chǎn)生替代能源和減少環(huán)境污染的優(yōu)勢，近年來規(guī)?；託夤こ探ㄔO(shè)在國內(nèi)外得到了迅速發(fā)展[1-3]。沼液是沼氣生產(chǎn)的重要副產(chǎn)品，是一種養(yǎng)分含量全面、速效養(yǎng)分豐富、肥效穩(wěn)定的有機肥。將其有效利用，不僅可以帶來可觀的經(jīng)濟效益，而且具有顯著的社會效益[4]。國內(nèi)外許多學(xué)者對沼液的綜合利用進行了很多研究，主要集中于沼液作為有機肥在農(nóng)業(yè)生態(tài)中的應(yīng)用，包括對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、品質(zhì)的影響，對土壤理化性質(zhì)的影響，對環(huán)境的安全評價等[5-7]。

沼液除了具有肥力特性外，還具有抑菌、抗逆、殺死和抑制作物病蟲的作用，是理想的化學(xué)農(nóng)藥代替品[8]。前人關(guān)于沼液施用對作物病害防治的作用開展了大量研究，主要集中于水稻、小麥、玉米、棉花、煙草、甘薯、番茄、辣椒、黃瓜、茄、草莓等作物上。已有研究表明，沼液對某些植物病原真菌具有顯著抑制作用[9-10]，但關(guān)于雞糞沼液對果樹類病原菌抑制作用的研究還未見報道。本研究選擇對果樹(蘋果、葡萄)有較大影響的5種主要病原菌(蘋果輪紋病病菌、蘋果斑點落葉病病菌、葡萄灰霉病病菌、葡萄白腐病病菌、葡萄炭疽病病菌)進行雞糞沼液抑菌和殺菌試驗，分別研究不同濃度的雞糞沼液對這5種病原真菌的抑制效果和滅殺作用，旨在為進一步研究雞糞沼液抑制病原菌機制提供理論基礎(chǔ)，同時也為雞糞沼液應(yīng)用于果樹病害的田間防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沼液 沼液由山東民和生物科技股份有限公司提供，主要發(fā)酵原料為雞糞。

1.1.2 菌種 蘋果輪紋病病菌(Botryosphaeriadothidea)、蘋果斑點落葉病病菌(Alternariamali)、葡萄白腐病病菌(Coniothyriumdiplodiella)、葡萄炭疽病病菌(Glomerellacingulata)、葡萄灰霉病病菌(Botrytiscinerea)由山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護研究所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 上述5種病菌菌試驗均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，簡稱PDA)培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗前的準備 雞糞沼液濃度梯度的設(shè)定：將雞糞沼液用無菌水稀釋成5、10、25、50、100、300倍液6個濃度梯度，備用。

供試病原菌的培養(yǎng)：將已接種供試菌的PDA培養(yǎng)基平皿放入恒溫箱培養(yǎng)4～5 d，備用。

1.2.2 抑菌試驗操作 將培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌20 min，自然冷卻至溫度為30～40 ℃時，按照每100 mL PDA培養(yǎng)基中添加5 mL的比例，分別向盛有培養(yǎng)基的三角燒瓶中加入不同濃度的雞糞沼液，以無菌水作為對照，混合均勻后倒入平皿中。待平皿中培養(yǎng)基凝固后，在無菌條件下，用滅過菌的內(nèi)徑為 6 mm 的打孔器取相同大小的菌餅。將菌餅移至不同培養(yǎng)基平皿中央，菌絲面朝下(菌絲面與培養(yǎng)基接觸)，每個培養(yǎng)皿內(nèi)放置1個菌餅。將接菌后的培養(yǎng)皿置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)，在溫度為27 ℃的條件下培養(yǎng)。共培養(yǎng)7 d，每隔24 h用游標卡尺十字交叉法垂直測量培養(yǎng)基平皿上病原菌菌落的直徑，取其平均值，單位為mm，記數(shù)。每個處理5次重復(fù)。

1.2.3 殺菌試驗操作 在無菌條件下，用滅過菌的內(nèi)徑為 6 mm 的打孔器將完全被抑制的菌塊(雞糞沼液5倍液處理)移至空白PDA培養(yǎng)基平皿中央。將平皿放入恒溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h測量培養(yǎng)基平皿中病原菌菌落的直徑，記數(shù)，共培養(yǎng) 7 d。每個處理5次重復(fù)。

1.2.4 抑(殺)菌率計算公式 根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，按下面公式計算抑(殺)菌率：

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 18.0分析軟件進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞糞沼液對葡萄灰霉病病菌的抑制效果

由表1可知，雞糞沼液對葡萄灰霉病病原菌生長抑制作用明顯，且與其濃度呈正相關(guān)。試驗期間，5、10倍液雞糞沼液處理對葡萄灰霉病病菌抑制率均為100.00%。處理1 d后，25、50、100倍液雞糞沼液處理對葡萄灰霉病病菌抑制率分別為100.00%、100.00%、91.67%；隨著處理時間的延長，其抑菌效果略有下降，7 d后抑菌率分別為92.62%、83.07%、61.46%。300倍液雞糞沼液處理對葡萄灰霉病病菌抑制率較差，至試驗結(jié)束時抑菌率僅為11.33%。

2.2 雞糞沼液對葡萄白腐病的抑制效果

由表2可知，沼液濃度不同，其對葡萄白腐病的抑制作用有一定差異。5、10倍液雞糞沼液處理對葡萄白腐病病菌抑制率均為100.00%。處理1 d后，25、50、100倍液雞糞沼液處理對葡萄白腐病菌抑制率分別為100.00%、100.00%、89.29%；隨著處理時間的延長，其抑菌效果略有下降，試驗結(jié)束時抑菌率分別為90.68%、85.04%、58.35%。處理后7 d，300倍液雞糞沼液處理對葡萄白腐病病抑菌率僅為13.66%，抑制效果較差。

表1 雞糞沼液對葡萄灰霉病病原菌生長的抑制作用

表2 雞糞沼液對葡萄白腐病病原菌生長的抑制作用

2.3 雞糞沼液對葡萄炭疽病的抑制效果

由表3可知，雞糞沼液對葡萄炭疽病病菌抑菌作用差異明顯，且與其濃度密切相關(guān)。其中，5、10倍液雞糞沼液處理抑菌作用最為明顯，試驗結(jié)束時對葡萄炭疽病病原菌生長的抑制率分別為100.00%、78.15%，其他4個處理對葡萄炭疽病病菌抑菌率均在29.00%以下，抑菌效果不顯著。

表3 雞糞沼液對葡萄炭疽病病原菌生長的抑制作用

2.4 雞糞沼液對蘋果輪紋病的抑制效果

由表4可知，雞糞沼液對蘋果輪紋病病菌抑菌作用隨著沼液濃度的降低而逐漸減弱。其中，5、10倍液雞糞沼液處理抑菌作用最為明顯，試驗停止時對蘋果輪紋病病原菌生長的抑制率分別為100.00%、86.78%，其他4個處理對蘋果輪紋病病菌抑菌率均在26.00%以下，抑制作用不明顯或無抑制作用。

2.5 雞糞沼液對蘋果斑點落葉病的抑制效果

由表5可知，不同濃度的雞糞沼液對蘋果斑點落葉病病原菌生長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。其中，5倍雞糞沼液稀釋液處理抑菌作用最為明顯，抑菌率均為100.00%；處理 7 d 后， 10、25、50 倍液雞糞沼液稀釋液 3個處理抑菌率均在46%以下，抑制效果不明顯；100、300倍液雞糞沼液稀釋液2個處理對蘋果斑點落葉病病菌抑菌率為負值，說明這2個處理對蘋果斑點落葉病沒有抑制作用。

表4 雞糞沼液對蘋果輪紋病病原菌生長的抑制作用

表5 雞糞沼液對蘋果斑點落葉病病原菌生長的抑制作用

2.6 雞糞沼液對5種果樹病原菌的滅殺作用

病原菌不同，雞糞沼液對其滅殺作用存在差異。由表6可知，雞糞沼液稀釋5倍后對葡萄灰霉病病菌、蘋果輪紋病病菌、蘋果斑點落葉病病菌的生長都表現(xiàn)出極強的滅殺作用，7 d 試驗中，滅菌率均為100.00%，但對葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌滅殺作用稍差。處理1、2 d后，其對葡萄炭疽病病菌滅殺率均為100.00%，對葡萄白腐病病菌滅殺率分別為63.70%、44.09%，隨著處理時間的延長，其滅菌效果逐漸減弱。至7 d時，雞糞沼液5倍稀釋液對葡萄炭疽病病菌和葡萄白腐病病菌滅菌率分別為45.29%、30.35%。

表6 雞糞沼液對5種果樹病原菌生長的滅殺作用

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

3 討論

沼液對許多植物病原真菌具有明顯的生長抑制作用[8，10-12]，但相關(guān)研究主要集中在以豬糞、牛糞為發(fā)酵原料的沼液上。由于沼液的成分受發(fā)酵原料、沼氣工程等工藝等因素的影響，不同沼液的理化及生物學(xué)性狀有很大差異，因此沼液對植物病害的防治效果并不完全一致[13]。

本研究以5種常見果樹病原菌為防治對象，分析以雞糞為發(fā)酵原料的沼液對這5種病原菌生長的抑制效果和滅殺作用。試驗結(jié)果表明，雞糞沼液對這5種病原菌的抑制效果與其濃度有關(guān)。雞糞沼液稀釋5倍后，均能完全抑制各種病原菌的生長。隨著沼液濃度的降低，其抑菌作用逐漸減弱。在同一濃度下，雞糞沼液對葡萄灰霉病和葡萄白腐病具有明顯的抑制作用，但對葡萄炭疽病、蘋果輪紋病和蘋果斑點落葉病的抑制效果較弱，說明同一沼液對不同病原菌的抑制作用存在差異，這與馬艷等的研究結(jié)論[14-15]一致。隨著處理時間的延長，雞糞沼液對5種果樹病原菌的抑菌作用逐漸減弱，這與尚斌等研究結(jié)果[13]矛盾，這可能與沼液發(fā)酵原料和病原菌種類不同有關(guān)。國內(nèi)關(guān)于沼液在植物病害防治上的應(yīng)用已有諸多報道，但主要集中在沼液對植物病原菌生長的抑制作用，并未對其殺菌作用進行深入研究。雞糞沼液對5種果樹病原菌殺菌試驗結(jié)果表明，雞糞沼液對葡萄灰霉病病菌、蘋果輪紋病病菌、蘋果斑點落葉病病菌的生長均表現(xiàn)出極強的滅殺作用，滅菌率均為100%，但對葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌滅殺作用稍差，這說明雞糞沼液對不同病原菌的滅菌效果有所不同。

葡萄灰霉病、葡萄白腐病、葡萄炭疽病、蘋果輪紋病、蘋果斑點落葉病是葡萄、蘋果等果樹生產(chǎn)中的重要病害[16-19]，對產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大[20-22]。目前對上述病害的防治仍以化學(xué)防治為主，但由于用藥不科學(xué)，多年持續(xù)使用單一藥劑，造成病原菌對一些殺菌劑已產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[23-26]。因此，亟須應(yīng)用無公害技術(shù)防治上述病害。沼液因無污染、無殘留、無抗藥性而被人們稱為“生物農(nóng)藥”，其用于植物病蟲害防治的研究已成為近年來的研究熱點。已有研究結(jié)果表明，用沼液替代化肥和農(nóng)藥，可減少20%以上的化肥和農(nóng)藥施用量，并顯著降低某些病害的發(fā)生率[9]。本試驗所用雞糞沼液已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，具有生產(chǎn)全流程自控、產(chǎn)品全生態(tài)性、沼液養(yǎng)分穩(wěn)定等工藝優(yōu)勢，克服了傳統(tǒng)沼液對病害防治效果不穩(wěn)定、重復(fù)性差的缺點。雞糞沼液稀釋50倍后對葡萄灰霉病、葡萄白腐病的抑制效果仍在80%以上，作為生物制劑其抑菌效果與部分化學(xué)農(nóng)藥相當，下一步將在田間驗證其對果樹病害的防治效果，并探索雞糞沼液與化學(xué)農(nóng)藥混和使用在果樹病害防治方面的可行性。

目前關(guān)于沼液抑菌防病效果的研究仍處于探索階段，本試驗在室內(nèi)研究雞糞沼液對5種果樹病原菌菌絲生長的抑制作用和滅殺效果，下一步將深入研究其對病原菌產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)的影響。雞糞沼液對病原菌的抑制作用與其濃度密切相關(guān)，今后將進一步分析沼液中主要抑菌、滅菌成分，更好地了解雞糞沼液抗病作用機制。

雞糞沼液對病原菌生長的抑制作用具有選擇性，且與其濃度呈正相關(guān)。雞糞沼液對葡萄灰霉病和葡萄白腐病具有強烈的抑制作用，但對葡萄炭疽病、蘋果輪紋病和蘋果斑點落葉病的抑制作用不明顯；隨著雞糞沼液濃度的降低，其對病原菌的抑制作用逐漸減弱。雞糞沼液對不同病原菌的滅殺效果存在差異，雞糞沼液稀釋5倍后能夠完全滅殺葡萄灰霉病病菌、蘋果輪紋病病菌、蘋果斑點落葉病病菌，但對葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌滅殺作用稍差。在田間對葡萄灰霉病、葡萄白腐病的防治推薦使用雞糞沼液50倍液，對其他3種病害的防治建議使用雞糞沼液10倍液。雞糞沼液對同一種病原菌的抑制作用和滅殺活性是不同的。雞糞沼液能夠完全抑制葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌的生長，但并不能將這2種病原菌全部殺死。研究結(jié)果可為雞糞沼液用于果樹病害環(huán)境友好型殺菌劑的進一步研究開發(fā)提供科學(xué)參考。