余青青， 王普昶， 趙麗麗， 陳 超， 唐華江， 李繼偉

(1.貴州大學動物科學學院草業(yè)科學系，貴州貴陽 550025； 2.貴州省草業(yè)研究所，貴州貴陽 550006；3.北京佰青源畜牧業(yè)科技發(fā)展有限公司，北京 100020)

燕麥(AvenasativaL.)別稱玉麥，屬禾本科(Gramineae)燕麥族(AveneaeDumort)燕麥屬(AvenaL.)，是重要的1年生牧草、飼料和糧食作物，為自花授粉植物[1]，主要分布在北半球溫帶地區(qū)的北美、歐洲、東部亞洲和大洋洲，播種面積和總產(chǎn)量僅次于小麥、水稻、玉米、高粱和大麥[2]。燕麥主要分為2種，一種是裸燕麥，是主要的糧食作物，且具有重要的藥用價值；另一種是皮(有殼)燕麥，含有豐富的營養(yǎng)價值，主要是飼用。燕麥的蛋白質(zhì)、脂肪、礦質(zhì)元素和維生素均高于小麥、水稻、玉米、高粱和大麥，鈣、磷、鐵、維生素E和賴氨酸的含量也都超過了其他谷類作物[3]。

飼用燕麥是高寒牧區(qū)人工草地廣泛種植的1年生草料兼用作物，具有適應性強、容易種植和飼用價值高等特點，在維系高寒牧區(qū)家畜越冬和抗災保畜中發(fā)揮著重要的作用。在貴州，飼用燕麥的生長旺季是晚秋和冬春季，具有生長快、籽實產(chǎn)量高等特點，是解決貴州省草地生態(tài)畜牧業(yè)冬春季節(jié)飼草料短缺的優(yōu)質(zhì)牧草。但長期以來，貴州省缺乏當家燕麥品種，推廣的品種主要從青海、甘肅、加拿大等地購進，所購進品種在該地適應性差、生產(chǎn)性能不穩(wěn)定。且從外地購種受影響因素較多，價格高，難以保證有長期、穩(wěn)定、廉價的燕麥品種為農(nóng)戶所用，導致燕麥種子供不應求。因此，培育出適宜當?shù)厣L的早熟、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)飼用燕麥新品種就顯得尤為重要。

遺傳多樣性不僅僅表現(xiàn)在表型性狀上的差異，更重要的是表現(xiàn)在蛋白質(zhì)、染色體和DNA水平上的差異。分子標記的發(fā)展為從DNA水平檢測品種及品系間的遺傳多樣性提供了有利的工具。ISSR技術(shù)是由Zietkiewicz等創(chuàng)建的一種新型的微衛(wèi)星類分子標記技術(shù)，具有高多態(tài)性、可重復性、低成本、易操作以及無須知道基因組序列等優(yōu)點，廣泛應用于多種作物和部分牧草的品種鑒定、系統(tǒng)分類、遺傳多樣性檢測、基因定位和遺傳圖譜構(gòu)建等研究中[4-6]。因此，本試驗利用ISSR分子標記的方法對7個皮燕麥品種進行遺傳多樣性分析，研究不同品種之間的遺傳差異，為飼用燕麥在貴州引種、遺傳改良、品種培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料分別為甘早、Baler、加燕2號、青海白燕麥、Hay Wire、青引2號、甜燕2號，均由北京佰青源畜牧業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。材料原產(chǎn)地及編號見表1。

表1 試驗材料編號及原產(chǎn)地

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 將材料播種于貴州大學試驗場，待出苗后20 d，每個材料隨機取20個單株的幼嫩葉片0.5 g均勻混合，使用植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取植物總DNA。用1.0%瓊脂糖、Gold View染色凝膠電泳檢測質(zhì)量，保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 燕麥ISSR分析

1.2.2.1 ISSR-PCR反應體系建立及引物篩選 通過查閱相關(guān)文獻資料[7-11]以及預試驗，最終確定最佳反應體系為 20 μL：2×EasyTaqPCR Super Mix 10 μL、引物1 μL、DNA模板(15 ng/μL)2 μL、ddH2O 7 μL。反應程序為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性30 s，50～56 ℃(不同引物的溫度不同)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。ISSR引物是根據(jù)加拿大哥倫比亞大學公布的100個引物序列，選出50個交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通過進一步預試驗，篩選引物。引物篩選以同一燕麥的DNA為模板，設(shè)置不同的溫度梯度，將所有引物在不同的溫度下進行PCR擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶清晰且具有多態(tài)性的引物作為此次燕麥ISSR的引物。

1.2.2.2 ISSR擴增產(chǎn)物的檢測 PCR反應結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳中檢測。電泳條件：上樣7 μL，1×TAE電泳緩沖液，120 V的電壓32 min。電泳完畢后用Bio-Rad凝膠成像儀Gel Doc XR+成像，觀測、保存并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

對PCR產(chǎn)物電泳的結(jié)果進行量化，通常認為ISSR是顯性標記，同一條引物擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，在相同位移上有擴增帶的記為1，無條帶的記為0，記錄清晰的電泳圖譜條帶，統(tǒng)計多態(tài)性位點，計算多態(tài)比率。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用NTSYS2.1、Popgene 32、Excel等軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的檢測

DNA電泳檢測結(jié)果見圖1。電泳條帶清晰且亮度高，說明所提取的DNA純度高，沒有被RNA、蛋白質(zhì)污染，可以進行后續(xù)的研究工作。

2.2 ISSR引物篩選

同一燕麥的DNA在不同退火溫度下進行PCR擴增，從50條ISSR引物中篩選出17條能夠擴增出清晰條帶且具有多態(tài)性的引物，引物的詳細序列見表2。圖2為退火溫度 54.6 ℃ 時，24個UBC引物擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳獲得的圖譜。根據(jù)試驗要求，從圖2中選出7號引物UBC855在54.6 ℃退火溫度下擴增燕麥DNA。其他引物的篩選過程與此相似。

表2 17條ISSR引物擴增結(jié)果

2.3 ISSR引物擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

利用17條ISSR引物對7個燕麥品種的DNA進行PCR擴增，共獲得204條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性條帶103條，平均多態(tài)性比率為50.49%，擴增的DNA片段集中在200～2 000 bp，部分擴增產(chǎn)物結(jié)果見圖3。平均每個引物擴增出12條帶，6.06條具有多態(tài)性(表2)，其中多態(tài)性最高的為 63.64%(引物UBC844和UBC840)，低的只有15.38%(引物UBC888)。

本試驗通過3次重復可以看出，擴增出的DNA片段長度基本相同，重復性較高，只有較弱的條帶重復性差。說明引物的重復性好，可以繼續(xù)后續(xù)的燕麥間遺傳多樣性研究，以及品種間遺傳距離的分析，為燕麥引種及雜交育種奠定基礎(chǔ)。

2.4 ISSR標記的遺傳相似性分析

采用Popgene 32軟件計算燕麥品種間的遺傳相似系數(shù)(GS值)，得到供試品種的相似性矩陣(表3)。遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近；遺傳相似系數(shù)越小，表明親緣關(guān)系越遠。7個燕麥品種的GS值為0.855～0.945，變幅為0.09。其中，加燕2號和Hay Wire二者之間的遺傳相似系數(shù)最大(0.945)，表明加燕2號和Hay Wire的親緣關(guān)系較近，遺傳差異最??；早甘和青海白燕麥遺傳相似系數(shù)最小(0.855)，表明早甘和青海白燕麥的親緣關(guān)系較遠，遺傳差異最大，存在較高的遺傳多樣性。遺傳相似性分析可知，供試品種之間有一定的遺傳差異性。

表3 基于ISSR標記的7種燕麥的遺傳相似系數(shù)矩陣

2.5 ISSR標記聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，利用NTSYS 2.1軟件進行聚類分析。在遺傳相似系數(shù)為0.914時，7種燕麥分為4類(圖4)，第1類為甘早，其產(chǎn)地為我國甘肅山丹；第2類包括加燕2號、Hay Wire、青引2號和甜燕2號，其中加燕2號、Hay Wire、甜燕2號原產(chǎn)地為加拿大；第3類為Baler，其產(chǎn)地為加拿大；第4類為青海白燕麥，其產(chǎn)地為我國青海。聚類結(jié)果初步證實了ISSR分子標記對7種燕麥進行親緣關(guān)系分析的可行性。

3 結(jié)論與討論

燕麥表型性狀的數(shù)量是有限的，容易受到外界環(huán)境的影響，從傳統(tǒng)的形態(tài)學分類方法來區(qū)分較難。分子標記能從DNA水平上檢測遺傳變異，被認為是物種親緣關(guān)系研究的有力工具。劉歡等利用8個ISSR引物在48份燕麥材料中共獲得144條擴增帶，其中多態(tài)性條帶126條，平均多態(tài)率為 86.1%[7]；王茅雁等利用RAPD標記對我國21份燕麥材料的遺傳差異及類群劃分的研究中，22個多態(tài)性引物共擴增出114條條帶，其中85.1%具有多態(tài)性[12]。Pal等用RFLP分析燕麥屬13個種間存在41%的多態(tài)性[13]。本研究從50個ISSR引物中篩選出17個多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應穩(wěn)定的引物，共擴增了204條譜帶，多態(tài)性條帶有103條，平均每個引物能擴增出12個條帶，多態(tài)性比率為50.49%。與以上研究結(jié)果相比，在檢測技術(shù)上，本研究使用的技術(shù)是相對成熟的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其檢測結(jié)果比較可靠。另外，燕麥是自花授粉植物，利用ISSR標記分析的準確性也相對較高。在檢測結(jié)果方面，各研究中相關(guān)的分子標記都能產(chǎn)生各自有效的多態(tài)性條帶，但本研究揭示的燕麥品種間遺傳差異相對較小，這可能是供試品種數(shù)量少和所選品種種性差異所致。

本研究利用ISSR技術(shù)所統(tǒng)計的遺傳相似系數(shù)，能反映不同材料間的遺傳距離及關(guān)系。供試的7個燕麥品種的遺傳相似系數(shù)(GS)0.855～0.945，表明供試燕麥品種間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離的變化范圍相對較小。其中，加燕2號和Hay Wire二者之間的遺傳相似系數(shù)最大(0.945)，表明加燕2號和Hay Wire的親緣關(guān)系較近，遺傳差異最小，因為兩者都來自同一原產(chǎn)地，育種時是否擁有共同祖先還須進一步查證；甘早和青海白燕麥遺傳相似系數(shù)最小(0.855)，表明甘早和青海白燕麥的親緣關(guān)系較遠，遺傳差異最大，可能是因為2個品種來自不同的地方，由于地域、環(huán)境等差異造成品種間存在較大的遺傳差異，又或者因其父母本之間具有相對較遠的遺傳距離。在植物雜交育種中，具有較大遺傳距離的2個種或品種之間更容易獲得遺傳性狀較多的雜交種。因此，在得知各品種間遺傳距離的情況下，能夠科學地指導雜交育種和品種改良的進行?？傊狙芯恐饕槍F州省目前引進的品種開展遺傳差異鑒定，所得結(jié)果能較好地為貴州省燕麥育種提供理論依據(jù)。