王學(xué)娟

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000)

低溫是影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要非生物脅迫之一，不僅限制植物的種植范圍，而且還會(huì)造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)的下降[1]。我國(guó)大部分地區(qū)位于暖溫帶和亞熱帶，植物對(duì)低溫的影響非常敏感，即便是很小的降溫幅度，也會(huì)給一些植物造成直接或間接損害[2]。冷害幾乎每年都會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)^收[3]。低溫脅迫直接抑制植物細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝和多種生理生化反應(yīng)，間接引起植物細(xì)胞的滲透脅迫、氧化脅迫和其他脅迫，同時(shí)低溫能使植物細(xì)胞吸水速率降低，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，這種傷害是不可逆的[4]。我國(guó)東北地區(qū)葡萄酒工業(yè)產(chǎn)品發(fā)展緩慢，影響其發(fā)展的主要因素是釀酒的原料不足。東北地區(qū)冬季嚴(yán)寒，無(wú)霜期較短，有效積溫不足，一些釀酒葡萄品種很難完全成熟，如赤霞珠葡萄等。因此，選育出適應(yīng)寒帶地區(qū)氣候條件的釀酒葡萄新品種，是我國(guó)東北寒帶地區(qū)葡萄酒工業(yè)快速發(fā)展的一個(gè)重要前提條件。北冰紅葡萄是國(guó)內(nèi)推出的適宜釀酒的葡萄新品種，具有抗寒豐產(chǎn)等特點(diǎn)，不僅適于大面積的生產(chǎn)果實(shí)，也是良好的觀賞植物，發(fā)展前景廣闊[5]。但也有研究表明，北冰紅在吉林省吉林市等地區(qū)露地越冬，植株地上部枝蔓仍會(huì)發(fā)生凍害，萌芽率僅為21.3%，造成減產(chǎn)[6]，因此提高葡萄的耐寒性具有現(xiàn)實(shí)的意義。

COR基因家族參與低溫脅迫的調(diào)節(jié)。Breton等在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)并克隆出COR413基因[7]。目前已報(bào)道的家族成員有COR6.6、COR15a、COR47、COR78、COR413等[8-9]。COR413蛋白家族為植物所特有，包括定位于細(xì)胞膜上的細(xì)胞膜型冷適應(yīng)蛋白COR413-PM(COR413-plasma membrane proteins)及定位于類(lèi)囊體膜上的類(lèi)囊模型冷適應(yīng)蛋白COR413-TM(COR413-thylakoid membrane proteins)2類(lèi)具有明顯區(qū)別的蛋白組。研究表明，編碼COR413蛋白的基因家族在擬南芥和谷類(lèi)等草本植物的抗凍性形成中發(fā)揮著重要的作用[10]。本研究以耐寒性較強(qiáng)的北冰紅葡萄為材料，利用PCR技術(shù)，獲取北冰紅耐寒基因VvCOR413-I2，并進(jìn)行分子特征分析，以期為進(jìn)一步研究VvCOR413-I2基因的轉(zhuǎn)化和功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

選擇山葡萄品種北冰紅為試驗(yàn)材料，由河北昌黎葡萄種植園提供。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。RNAiso Plus試劑盒、PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase試劑盒、Ex-Taq、pMD-19T Easy Vector，均購(gòu)自TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA

采取北冰紅葡萄幼嫩葉片，按照RNAiso Plus試劑盒和PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成。

1.3 COR413-I2基因引物設(shè)計(jì)及全長(zhǎng)克隆

通過(guò)https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html檢索葡萄(Vitisvinifera)Genoscope.12X基因組中COR413基因序列，并在NCBI上檢索其他植物COR413基因序列，對(duì)葡萄基因組中COR413基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物COR413-I2-F：3′-ATGGGGAAAAAGGGTTACT-TGGCG-5′，下游引物COR413-I2-R：3′-CTATAGGAAGT-GAAGTACCAGAGCC-5′，引物由華大基因合成。

參照TaKaRa公司的Ex-Taq說(shuō)明書(shū)，以cDNA為模板，利用Ex-TaqBuffer，Ex-Taq，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)和引物COR413-I2-F/COR413-I2-R擴(kuò)增COR413-I2全長(zhǎng)。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、分析、拍照后，回收目的片段，與pMD19-T Easy Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)，將感受態(tài)活化培養(yǎng)，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性菌進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，選取3個(gè)檢測(cè)為陽(yáng)性的菌液送至北京華大中生科技發(fā)展有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN、TMHMM、Blast、WOLF PSORT等生物信息學(xué)軟件對(duì)該序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行分子特征分析和結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取和檢測(cè)

RNA提取電泳結(jié)果(圖1)中可見(jiàn)清晰的3條條帶，分別為5S、18S、28S RNA，純度檢測(cè)結(jié)果為D260 nm/D280 nm=2.10，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2.2 COR413-I2基因全長(zhǎng)克隆及檢測(cè)結(jié)果

以北冰紅葡萄葉片cDNA為模板可以擴(kuò)增出609 bp大小的基因片段(圖2)，與葡萄基因組中COR413基因大小一致。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，初步推測(cè)目的基因成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中(圖3)。

2.3 VvCOR413-I2基因及氨基酸分子特征分析

通過(guò)測(cè)序結(jié)果分析，成功克隆出VvCOR413-I2全長(zhǎng)(圖4)。該基因編碼202個(gè)氨基酸殘基，編碼的蛋白分子量為22.6 ku，等電點(diǎn)值為9.88，pH值為7.0時(shí)電荷為6.88。對(duì)VvCOR413-I2編碼的氨基酸序列與麻風(fēng)樹(shù)(Jatrophacurcas)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、可可樹(shù)(Theobromacacao)、榴蓮(Duriozibethinus)、橡膠(Heveabrasiliensis)等植物的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性在78%以上。其中與橡膠的同源性最高，同源性為85%(圖5)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，VvCOR413-I2蛋白與上述5種植物的COR413-I2具有較近的親緣關(guān)系(圖6)。

2.4 COR413-I2蛋白的結(jié)構(gòu)特性

利用NCBI的Conserved Domains功能對(duì)COR413-I2蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，VvCOR413-I2編碼的蛋白含有WCOR413蛋白的功能域(圖7)，屬于WCOR413超家族成員；運(yùn)用SOPMA軟件對(duì)COR413-I2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白存在81個(gè)α螺旋、17個(gè)β轉(zhuǎn)角、43個(gè)延伸鏈、61個(gè)隨機(jī)線圈；COR413-I2蛋白含有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(圖8)。

3 結(jié)論與討論

冷害時(shí)常會(huì)使植物發(fā)生淀粉轉(zhuǎn)化為糖、二氧化碳交換減少、凈光合速率降低、葉綠素降解等生理機(jī)能失調(diào)的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至死亡[11]。COR413蛋白在感應(yīng)到冷害脅迫信號(hào)后，通過(guò)維持植物細(xì)胞膜的穩(wěn)定性來(lái)減少冷害對(duì)植物細(xì)胞的傷害， 其結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物的視紫質(zhì)類(lèi)似G蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupled receptor，簡(jiǎn)稱(chēng)GPCR)蛋白家族相似[4，12]，但二者機(jī)制是否相似或相同有待進(jìn)一步研究。現(xiàn)在已有大量研究證明，COR413蛋白家族在植物應(yīng)對(duì)冷脅迫的機(jī)制中起著重要的作用，冷脅迫下丹參、針葉福祿考等植物的COR413基因表達(dá)量明顯提高[13-14]。COR413基因的異源表達(dá)結(jié)果表明，將檉柳的冷適應(yīng)蛋白基因轉(zhuǎn)入粳稻中，轉(zhuǎn)基因粳稻的耐寒性明顯高于對(duì)照組[15]， 轉(zhuǎn)蠟梅COR413基因的煙草同樣表現(xiàn)出較高的耐寒性[16]。轉(zhuǎn)番茄COR413基因的煙草不僅在冷脅迫下正常生長(zhǎng)，同時(shí)在干旱脅迫時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)能力[17]，表明COR413家族在響應(yīng)冷脅迫的同時(shí)還可以響應(yīng)干旱脅迫。本研究以耐寒葡萄品種北冰紅葉片為試驗(yàn)材料，克隆出VvCOR413-I2基因并對(duì)該基因進(jìn)行了特征分析，為分析該基因的功能及通過(guò)基因工程手段選育抗寒葡萄新品種奠定基礎(chǔ)。