成蕾，肖云峰，李孝瓊，李佳麗，夏金蓉，李思宇，冷政偉

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 神經(jīng)外科，湖北 武漢 430022；2.川北醫(yī)學(xué)院 肝膽胰腸疾病研究所，四川南充 637000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率和病死率在我國(guó)惡性腫瘤中排名第五；在美國(guó)已躍居第三，居消化系統(tǒng)腫瘤第一位[1-2]，其已經(jīng)成為重大的社會(huì)問(wèn)題[3]；肝臟是CRC最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，約有60%的CRC患者在病程中出現(xiàn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（colorectal liver metastases，CRLM），其中大部分無(wú)法手術(shù)切除，CRLM也是CRC患者最主要的死亡原因[4]。大量研究[5-6]證實(shí)，腫瘤中一小群具有強(qiáng)大自我更新能力和多向分化能力的細(xì)胞介導(dǎo)了腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，這一群細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）。因此，從CSCs角度深入探討CRC轉(zhuǎn)移信號(hào)通路的機(jī)制是CRC及其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要研究方向。目前科學(xué)家通過(guò)標(biāo)記CD133、CD44、ALDH1、Lgr5、SP等來(lái)分析分選CRC-CSCs，其中CD133+CD44+被認(rèn)為是CRCCSCs可靠的表面標(biāo)識(shí)[7]。

大量研究[8-9]證實(shí)Wnt/β-catenin的異常激活介導(dǎo)了CRC的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，但Wnt/β-catenin通路對(duì)CRC-CSCs自我更新、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制未見(jiàn)研究。小分子藥物FH535能夠通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路影響細(xì)胞的多種病理生理過(guò)程[10]，如Liu等[11]證明，F(xiàn)H535能夠與紫杉醇協(xié)同進(jìn)一步抑制胃癌細(xì)胞增殖及侵襲能力；Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)FH535通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲遷移能力。但FH535在介導(dǎo)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)根源細(xì)胞即CRC-CSCs中的作用及機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。故本課題首先分選CD133+CD44+的CRC-CSCs，將Wnt/β-catenin通路抑制劑FH535作用于CSCs，研究此通路在人CRC-CSCs自我更新、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、7-氨基-放線菌素D（7-AAD）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰島素、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、BSA、B27購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；CD133-PE、CD44-FITC及對(duì)應(yīng)同型對(duì)照流式細(xì)胞抗體購(gòu)自德國(guó)美天妮公司；FH535購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司；LEF1、AXIN1、c-myc、VEGF、cyclin D1及survivin一抗及相應(yīng)二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；所有引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)參考課題組前期文章[13]。前期研究已經(jīng)證明結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)情況下能夠獲得更多的CSCs，故本課題通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選獲得的DLD-1細(xì)胞中CD133+CD44+的CRC-CSCs培養(yǎng)于含5 mg/mL胰島素、0.4%BSA、2%B27、10 ng/mL FGF、10 ng/mL EGF的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分選CD133+CD44+表達(dá)的CRC-CSCs 2×106細(xì)胞加入1 mL封閉液（含20%胎牛血清及0.4%BSA的PBS）4 ℃作用2 h后離心收集細(xì)胞并懸浮于50 μL封閉液中，加入5 μL CD133-PE、5 μL CD44-FITC 及其同型對(duì)照抗體，4 ℃避光孵育30 min，離心收集細(xì)胞并懸浮于1 mL冷PBS中，分選上機(jī)前加入終濃度為2 μg/mL的7-AAD室溫染色10 min以利分選時(shí)去除死細(xì)胞，使用BD FACSAria Fusion流式細(xì)胞儀分選獲得CD133+CD44+表達(dá)的CRC-CSCs。

1.2.3 有限濃度稀釋法 細(xì)胞以每孔不同濃度（0.5、1、1.5、2個(gè)細(xì)胞/孔）接種于96孔板中培養(yǎng)2周后記錄每孔中細(xì)胞球數(shù)量，陰性孔比例與細(xì)胞稀釋濃度作圖并進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算CSCs 比例[14]。

1.2.4 成球?qū)嶒?yàn)及Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法參考課題組研究[15]，3×105細(xì)胞懸浮于50 μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于8 μm孔徑濾膜的Transwell小室上室，小室為100 μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，小室鋪設(shè)基質(zhì)膠（侵襲實(shí)驗(yàn)）或不鋪設(shè)基質(zhì)膠（遷移實(shí)驗(yàn)），細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育15 h，遷移侵襲通過(guò)濾膜的細(xì)胞被0.1%結(jié)晶紫在室溫下染色10 min，顯微鏡下照相、計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)[7]。

1.2.5 實(shí)時(shí)遷移侵襲實(shí)驗(yàn) 參考課題組前期發(fā)表研究[15]。采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析（RTCA）平臺(tái)，細(xì)胞遷移侵襲到下層接觸電極板產(chǎn)生電信號(hào)，通過(guò)系統(tǒng)換算為細(xì)胞指數(shù)，該指數(shù)大小與細(xì)胞數(shù)成正比，每15 min檢測(cè)1次信號(hào)，以實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力。

1.2.6 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法參考課題組前期研究[7,13]，采用TRIzol法提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green法檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)。95 ℃預(yù)溫10 min，95 ℃變性10 min為一循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，60 ℃作用10 s退火后，72 ℃作用10 s延伸以檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，GAPDH作為內(nèi)參，2-△△Ct表示基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：GAPDH：5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'，5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'；LEF1：5'-CAA ATA AAG TGC CCG TGG TG-3'，5'-GGA CAT GCC TTG TTT GGA GT-3'；AXIN1：5'-CAT GAC GGA CAG CAG TGT AGA TG-3'，5'-GGG TTC TCG GGA AAT GAG GTA G-3'；c-myc：5'-CCA CAG CAA ACC TCC TCA CA-3'，5'-CTG ACA CTG TCC AAC TTG ACC C-3'；VEGF：5'-ATC CAA TCG AGA CCC TGG TG-3'，5'-ATC TCT CCT ATG TGC TGG CC-3'；cyclin D1：5'-CGG ACT ACA GGG GAG TTT TG-3'，5'-AGG AGG TTG GCA TCG GGG T-3'；survivin：5'-GAA ACT GCG GAG AAA GTG CG-3'，5'-GAA TAA ACC CTG GAA GTG GTG C-3'。

1.2.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)方法參考課題組前期研究[7]，96孔板中每孔接種1×103細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后加入CCK-8試劑10 μL，室溫下孵育15 min后，獲取每孔在450 nm處的讀數(shù)并輸入SPSS軟件計(jì)算FH535對(duì)CRC-CSCs的半數(shù)抑制率濃度（IC50）及時(shí)間作為后續(xù)研究使用濃度。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Wnt/β-catenin通路蛋白質(zhì)表達(dá)2×105細(xì)胞使用BD穿膜液在室溫下固定40 min，然后與1/100比例的一抗在4 ℃避光下孵育40 min；冷PBS洗滌后與FITC和APC標(biāo)記的1:100二抗在37 ℃下孵育30 min；不添加一抗，直接與1:100二抗孵育設(shè)定為同型對(duì)照。冷PBS洗滌后細(xì)胞懸浮于500 μL PBS中，上機(jī)檢測(cè)，獲得數(shù)據(jù)使用FlowJo 10.0軟件進(jìn)行分析。平均熒光強(qiáng)度比值與蛋白質(zhì)表達(dá)量成正比，平均熒光強(qiáng)度比值=樣本平均熒光強(qiáng)度/對(duì)應(yīng)同型對(duì)照樣本平均熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD133+CD44+ CRC-CSCs特征的鑒定

首先分選出CD133+CD44+細(xì)胞（圖1A），再采用國(guó)際通用的成球?qū)嶒?yàn)來(lái)鑒定其腫瘤干細(xì)胞特征，數(shù)據(jù)顯示：CD133+CD44+與CD133-CD44-細(xì)胞成球數(shù)量分別為324.33±9.29，18.33±3.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=54.19，P=0.00），與其他研究組結(jié)論相同[16]（圖1B）。提示CD133+CD44+是研究CRC-CSCs可靠的細(xì)胞模型。

圖1 CRC-CSCs的分選與鑒定 A：流式細(xì)胞術(shù)分選CD133+CD44+（P3）及CD133-CD44-（P4）細(xì)胞；B：成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力Figure 1 Sorting and identification of CRC-CSCs A: Fluorescence-activated cell sorting for isolation of CD133+CD44+ (P3) and CD133–CD44– (P4) cells; B: Sphere-forming assay for determination of self-renewal ability

2.2 FH535藥物濃度的確定

1×103CRC-CSCs接種于96孔板中，使用不同濃度FH535作用0、24、48、72 h，對(duì)照組不加入藥物。采用CCK-8法檢測(cè)酶標(biāo)儀在450 nm處的讀數(shù)輸入SPSS 19.0軟件計(jì)算確定FH535的IC50為40 μmol/L，并作為后續(xù)研究使用濃度。

2.3 FH535對(duì)CRC-CSCs自我更新能力的影響

采用成球?qū)嶒?yàn)及有限濃度稀釋法檢測(cè)CRCCSCs自我更新能力的變化。成球?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)顯示：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞球數(shù)量為57.33±5.03、313.67±13.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-31.74，P=0.00）；有限濃度稀釋法結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組CRC-CSCs成球比例分別為11.60/100±1.60/100、75.50/100±3.98/100，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-25.81，P=0.00）。

2.4 FH535對(duì)CRC-CSCs遷移、侵襲能力的影響

采用傳統(tǒng)的Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞遷移侵襲能力變化。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為10.66±2.08、90.00±5.00（t=-25.37，P=0.00）；侵襲細(xì)胞數(shù)分別為8±1，20±5（t=-4.08，P=0.015）（圖2A）。由于CRC-CSCs數(shù)量較少，進(jìn)一步采用RTCA平臺(tái)實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞在25 h后的遷移侵襲能力變化。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組遷移細(xì)胞指數(shù)分別為0.17±0.05、0.37±0.09（t=3.38，P=0.03）；侵襲細(xì)胞指數(shù)分別為0.14±0.04、0.37±0.07（t=-5.05，P=0.007）（圖2B）。

2.5 FH535對(duì)CRC-CSCs中Wnt/β-catenin通路的影響

最后對(duì)FH535抑制CSCs自我更新、遷移侵襲能力的機(jī)制進(jìn)行探討，通過(guò)qRT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵基因LEF1、AXIN1及下游基因c-myc、VEGF、cyclin D1、survivin的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)變化[17]。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中LEF1、AXIN1、c-myc、VEGF、cyclin D1、survivin的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.15±0.14、1.72±0.18、1.38±0.46、1.72±0.06、1.12±0.12、1.27±0.04及2.33±0.22、3.19±0.32、2.22±0.28、3.95±0.09、2.61±0.07、1.98±0.03（t=-7.871、-7.02、-5.07、-20.39、-16.10、-24.60，均P＜0.00）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)顯示：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中LEF1、AXIN1、c-myc、VEGF、cyclin D1、survivin的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量為0.48±0.07、0.82±0.05、0.38±0.05、1.38±0.06、0.67±0.08、0.27±0.06及1.27±0.07、1.70±0.05、0.93±0.07、2.30±0.31、1.56±0.11、0.90±0.02（t=-13.79、-21.68、-11.16、-4.94、-11.19、-18.45，均P＜0.01）（圖3）。

圖2 細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測(cè) A：Transwell法；B：RTCAFigure 2 Measurement of migration and invasion abilities A: Transwell assay; B: RTCA

圖3 qRT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)Figure 3 Detection of the the mRNA and protein expressions by qRT-PCR and flow cytometry

3 討 論

大量研究[18-19]證實(shí)Wnt/β-catenin通路的異常激活是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵因素，因此Wnt/β-catenin通路已經(jīng)成為結(jié)直腸癌治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。一部分Wnt/β-catenin通路抑制劑例如OMP-18R5、OMP-54F28、PRI-724等已經(jīng)進(jìn)入結(jié)直腸癌治療的臨床實(shí)驗(yàn)[20]。與上述抑制劑機(jī)制不同的是，F(xiàn)H535通過(guò)抑制激活因子GRIP1和β-catenin對(duì)PPARγ和PPARδ的募集作用，進(jìn)一步抑制β-catenin/TCF-轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路抑制發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[10,21-22]。

最新研究[23]證明，CSCs介導(dǎo)了腫瘤的耐藥、遷移侵襲及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。目前已有FH535抑制普通腫瘤細(xì)胞惡性行為的研究，但在決定腫瘤預(yù)后的CSCs中卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。故本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選出CD133+CD44+的CRC-CSCs，探討FH535對(duì)CSCs自我更新、遷移侵襲的影響及機(jī)制。細(xì)胞通過(guò)自我更新產(chǎn)生至少一個(gè)完全保留干性特征的子代細(xì)胞，以維持其干細(xì)胞潛能；同時(shí)獲得另外一個(gè)腫瘤細(xì)胞以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞群的生長(zhǎng)[24]。研究已經(jīng)證實(shí)，自我更新能力是CSCs介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的根源。本研究通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)及有限濃度稀釋法證實(shí)FH535作用后CRC-CSCs自我更新能力受到明顯抑制。

腫瘤細(xì)胞由原發(fā)病灶處脫離，通過(guò)淋巴系統(tǒng)、血液循環(huán)等途徑在轉(zhuǎn)移器官中定植并繼續(xù)增殖形成轉(zhuǎn)移灶。細(xì)胞的遷移侵襲能力是決定CSCs能否轉(zhuǎn)移成功的最重要因素之一，因此本研究觀察FH535是否對(duì)CRC-CSCs遷移侵襲能力產(chǎn)生直接影響。本研究Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)遷移侵襲實(shí)驗(yàn)均提示，F(xiàn)H535作用CRC-CSCs后，細(xì)胞遷移侵襲能力明顯被削弱。最后，本研究探討FH535抑制CRC-CSCs自我更新、遷移侵襲的分子機(jī)制。qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)H535作用CRC-CSCs后，細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路基因LEF1、AXIN1及下游基因c-myc、VEGF、cyclin D1及survivin的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)；而后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了上述基因蛋白質(zhì)表達(dá)變化，與mRNA表達(dá)情況一致。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測(cè)多采用Western blot技術(shù)，該技術(shù)操作流程相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，但檢測(cè)需要2～3 d、所需細(xì)胞大概為1～2×106個(gè)細(xì)胞/樣本。而課題組研究提示CRCCSCs所占比例極小（0.5%左右），甚至無(wú)法檢測(cè)，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)無(wú)疑十分困難。所以本課題組采用高靈敏度的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)由于技術(shù)含量相對(duì)較高而沒(méi)有廣泛開(kāi)展，但其具有操作時(shí)間短、所需樣本少、檢測(cè)更加準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)只需要1×105個(gè)細(xì)胞/2樣本在3 h內(nèi)即可獲取蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，其檢測(cè)精度并不亞于Western blot技術(shù)[25-26]。

綜上，本研究在純化的CRC-CSCs中發(fā)現(xiàn)FH535可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，最終導(dǎo)致CSCs自我更新、遷移侵襲能力明顯削弱。結(jié)果可能為靶向抑制CSCs介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供新的思路。