陳天拓 何晶晶 蘇義林 朱 凱

兒童期腎臟腫瘤多數(shù)來(lái)源于腎胚芽組織且多為惡性腫瘤，其中最常見(jiàn)的為腎母細(xì)胞瘤。Max Wilms于1899年對(duì)這類腫瘤的特點(diǎn)進(jìn)行了描述，故稱Wilms瘤。腎母細(xì)胞瘤約占小兒實(shí)體瘤的8%，并有一定的家族遺傳性，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與WT基因突變和/或腎源性剩余有關(guān)[1]。根據(jù)腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)，腫瘤由一小部分維持正常干細(xì)胞共同特征的腫瘤干細(xì)胞維持。隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤的根源，其含量與腫瘤的惡性程度、預(yù)后存在相關(guān)性[2]。CD133首先被發(fā)現(xiàn)是造血系統(tǒng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的標(biāo)志物[3]，隨后發(fā)現(xiàn)在很多類型腫瘤的干細(xì)胞中均表達(dá)CD133[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CD133是小兒惡性腫瘤中最常見(jiàn)的干細(xì)胞標(biāo)志物，包括腎母細(xì)胞瘤[5]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[6]、肝母細(xì)胞瘤[7]和骨肉瘤[8]。CD133的表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)，可作為其重要的預(yù)后分子標(biāo)志物。CD44是細(xì)胞表面糖蛋白，主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)是乳腺癌[9]、頭頸腫瘤[10]、胰腺癌[11]和腸癌[12]干細(xì)胞標(biāo)志物。本研究探討腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平及其與患者臨床分期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月至2017年10月在安徽省立醫(yī)院未進(jìn)行放化療而直接進(jìn)行手術(shù)治療的腎母細(xì)胞瘤患者，收集HE染色結(jié)果、病理報(bào)告以及臨床病理參數(shù)(包括年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度等)。

1.2 試劑和設(shè)備 多聚甲醛、石蠟、乙醇和二甲苯購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；抗體稀釋液、蘇木素染液、封片劑、免疫組化檢測(cè)(SP法)試劑盒(SP-9000)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CD133(ab19898)和CD44(ab6124)單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司(CX31)；石蠟包埋機(jī)(EG1150)和切片機(jī)(RM2235)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；離心管、槍頭和EP管購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。

1.3 組織切片制備和免疫組織化學(xué)染色 新鮮腫瘤組織用生理鹽水漂洗1次后用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成2～5 μm厚組織切片。免疫組織化學(xué)染色步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。蘇木精復(fù)染后，自來(lái)水洗15 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 免疫組織化學(xué)評(píng)分 為定量檢測(cè)CD133和CD44在腎母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況，采用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分法將CD133和CD44的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果判定采用雙盲法，由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師共同進(jìn)行。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)的顏色深淺判定陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度，無(wú)色為陰性記為0分，淺黃色為弱陽(yáng)性記為1分，棕黃色為中等強(qiáng)度記為2分，棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性記為3分。在高倍鏡下(200倍)對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算視野中陽(yáng)性細(xì)胞百分比，最終的免疫組織化學(xué)評(píng)分按照陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比，評(píng)分范圍為0～300分，以評(píng)分的中位數(shù)作為臨界值來(lái)區(qū)分陰性和陽(yáng)性標(biāo)本[13]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)或校正的χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般特征 共收集腎母細(xì)胞瘤患兒64例，其中男性30例(47%)，女性34例(53%)。年齡中位數(shù)為36個(gè)月(8～120個(gè)月)，其中46例(74%)年齡≤36個(gè)月。腫瘤大小(最大直徑)2～19 cm，中位數(shù)6.5 cm，其中32例(50%)≤6.5 cm。其中58例(91%)表現(xiàn)為預(yù)后好的病理特征；6例(9%)表現(xiàn)為預(yù)后差的病理特征，這6例中4例為局灶性增生，2例為彌漫性病變。根據(jù)NWTS分期[14]， 24例(37%)為1期，26例(41%)為2期，4例(6%)為3期，8例(12%)為4期，2例(3%)為5期。

2.2 CD133和CD44在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況 CD133陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度分析顯示，87%(56/64)的標(biāo)本為陽(yáng)性，其中44%(28/64)為弱陽(yáng)性，37%(24/64)為陽(yáng)性，6%(4/64)為強(qiáng)陽(yáng)性；CD133陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，28%(18/64)的標(biāo)本CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥50%。CD44陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度分析顯示，25%(16/64)的標(biāo)本為陽(yáng)性，其中13%(8/64)為弱陽(yáng)性，6%(4/64)為陽(yáng)性，6%(4/64)為強(qiáng)陽(yáng)性；CD44陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，13%(8/64)的標(biāo)本CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%(見(jiàn)圖1)。分別計(jì)算CD133和CD44最終的免疫組織化學(xué)評(píng)分，計(jì)算結(jié)果顯示評(píng)分的中位數(shù)為100分，因此，使用100分作為區(qū)分標(biāo)本陰性和陽(yáng)性的臨界值，其中44%(28/64)的標(biāo)本為CD133陽(yáng)性，13%(8/64)的標(biāo)本為CD44陽(yáng)性。

2.3 CD133的表達(dá)情況與腎母細(xì)胞瘤臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 CD133的免疫組織化學(xué)評(píng)分與腎母細(xì)胞瘤NWTS分期存在正相關(guān)性(r=0.813，P=0.047)。在4期標(biāo)本中CD133的陽(yáng)性率為87.5%，而在1期標(biāo)本中CD133的陽(yáng)性率為25.0%(6/24)。此外，女性患者CD133評(píng)分高于男性患者(P<0.05)，但CD133評(píng)分與患者的年齡、腫瘤的大小及病理特征無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD133和CD44在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)(HE×100)

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中的一小部分，它具有干細(xì)胞的特性(如自我更新)，能夠多向分化以及導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，表達(dá)一系列獨(dú)特的分子標(biāo)志物(如CD44和CD133)[15]。本研究探討了2個(gè)重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。通過(guò)免疫組織化學(xué)評(píng)分分析CD133和CD44在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況顯示，CD133在44%(28/64)的腎母細(xì)胞瘤中為陽(yáng)性，但與CD133相比，CD44在腎母細(xì)胞瘤中的陽(yáng)性率較低，僅為13%(8/64)。與其他腫瘤類似，在腎母細(xì)胞瘤中表達(dá)CD133的腫瘤細(xì)胞數(shù)目超過(guò)腫瘤干細(xì)胞的數(shù)目，因此單獨(dú)檢測(cè)CD133的表達(dá)水平不能用于鑒別腫瘤干細(xì)胞。目前，研究人員正試圖確定特定的標(biāo)記或通過(guò)一組標(biāo)志物來(lái)定義純腫瘤干細(xì)胞亞群。作為有效的靶向治療腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，必須能夠識(shí)別所有腫瘤細(xì)胞且只在腫瘤干細(xì)胞上表達(dá)[16]。在兒科腫瘤中已經(jīng)鑒定的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物數(shù)量有限，CD133是常見(jiàn)標(biāo)志物之一，然而它遠(yuǎn)非完美的干細(xì)胞標(biāo)志物。此外，在人腦膠質(zhì)瘤中CD133是生物能量學(xué)的壓力標(biāo)志物，在缺氧條件下CD133的表達(dá)水平顯著增加[17]，但還不能確定增加的C133陽(yáng)性細(xì)胞是來(lái)自腫瘤起始亞群還是來(lái)自有抗性的細(xì)胞群體。

人類腎臟腫瘤發(fā)生與器官發(fā)育有密切聯(lián)系[18]。對(duì)人胎腎干細(xì)胞標(biāo)志物和腎母細(xì)胞瘤中惡性腎干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定結(jié)果顯示，腎母細(xì)胞瘤起源于腎干細(xì)胞的過(guò)度增殖和積累[19]。針對(duì)腎母細(xì)胞瘤手術(shù)切除組織中干細(xì)胞標(biāo)志物的研究[5]顯示，其中表達(dá)CD133和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(CD56)，表明該腫瘤組織中存在干細(xì)胞，克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，只有表達(dá)CD56的細(xì)胞具有高克隆形成能力以及過(guò)表達(dá)腎母細(xì)胞瘤預(yù)后不良相關(guān)基因TOP2A。在腎母細(xì)胞瘤中分析CD133的表達(dá)水平與腫瘤分期及預(yù)后相關(guān)性的研究較少。已有研究顯示，CD133與兒童腫瘤相關(guān)，如骨肉瘤[8]和橫紋肌肉瘤[20]；在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例與化療耐藥性有強(qiáng)相關(guān)性，因此將CD133作為起源于神經(jīng)嵴腫瘤的干細(xì)胞標(biāo)志物[21]；在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，CD133的陽(yáng)性率與腫瘤INSS分期和分化水平低相關(guān)[6]；在兒童惡性黑色素瘤中，CD133與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[22]。本研究使用CD133作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物分析腎母細(xì)胞瘤中陽(yáng)性率達(dá)到44%，而且陽(yáng)性率與腫瘤分期呈正相關(guān)。

Balla等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞表面表達(dá)CD44并廣泛參與細(xì)胞黏附和遷移等。而且在很多成人腫瘤如乳腺癌、腸癌、胰腺癌和頭頸部腫瘤中均顯示CD44是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[9-12]。本研究結(jié)果顯示，CD44在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平低于CD133，因此在腎母細(xì)胞瘤中CD44可能不是合適的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。為明確CD133和CD44在腎母細(xì)胞瘤中是否可以作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，還需要進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)從腎母細(xì)胞瘤組織中分離CD133或CD44陽(yáng)性細(xì)胞，并鑒定其體外生物學(xué)特征。

目前，已從多種兒童腫瘤中鑒定出腫瘤干細(xì)胞，但關(guān)于兒童腫瘤干細(xì)胞的知識(shí)相對(duì)有限。由于成人和兒童腫瘤干細(xì)胞在存在形式、功能和行為方面差異較大，需要找出特定的標(biāo)志物來(lái)識(shí)別兒童腫瘤干細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，CD133可以作為兒童腎母細(xì)胞瘤的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，其陽(yáng)性率隨著晚期腫瘤分期的提高而增加，這意味著可以通過(guò)CD133靶向作用于腫瘤干細(xì)胞來(lái)治療兒童難治性或復(fù)發(fā)性腫瘤。