雷 波 詹 傲 張 召 張孝禮 萬曉強

膠質瘤是人類最致命的惡性腫瘤之一，每年導致超過40萬人死亡[1]，5年生存率低于15%[2]。目前，常用的膠質瘤經典腫瘤標志物有血清鱗狀細胞癌抗原(serum squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、碳水化合物抗原(carbohydrate antigen ，CA)19-9、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ，CEA)，但在早期診斷中缺乏敏感性和特異性[3-4]。因此，探索新的標志物對早期發(fā)現(xiàn)膠質瘤十分重要。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA ，lncRNA)長度超過200個堿基，缺乏蛋白質編碼能力，通過調控致癌和腫瘤抑制途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移中發(fā)揮關鍵作用[5-6]。lncRNA在多種腫瘤中常表達失調，其異常表達可作為多種人類惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌的潛在診斷或預后生物標志物[7-11]。本研究探討長鏈非編碼RNA ATB(long-chain non-coding RNA ATB，lncRNA ATB)在膠質瘤中的表達情況及調控miR-144對膠質瘤遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 病理組織收集 收集2017年1月至2018年1月樂山市人民醫(yī)院術前病理檢查確診為膠質瘤并行手術切除的腫瘤組織30份，同時取距癌灶2 cm的癌旁正常組織30份。取材后將組織樣品迅速放在入液氮中保存，至RNA提取。所有患者術前未行新輔助化療、放療，無手術禁忌證，并隨訪其生存時間和狀態(tài)。本研究通過院倫理委員會審批，患者及家屬術前均簽署知情同意書。

1.2 細胞培養(yǎng) 人膠質瘤細胞株U87、U251、SHG44和SWO-38購于上海復旦大學細胞研究所。1640培養(yǎng)基和0.25%胰酶購于美國 Gibco公司，胎牛血清購于美國?？寺」?，si-ATB購于上海吉瑪有限公司。U87、U251、SHG44和SWO-38胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中，每隔3 d換液1次，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底進行傳代。以下所有試驗均取處于對數(shù)生長期的細胞。

1.3 細胞轉染 使用PBS緩沖液將細胞清洗干凈，重復3次，胰酶消化細胞2 min，轉移至無菌15 mL離心管，離心并計數(shù)細胞，以每孔4×105個細胞接種于6孔板中，使融合率達70%左右，使用無血清培養(yǎng)基按3 μL/L進行稀釋轉染試劑，37℃孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基分別將si-ATB和對照組按50 μmol/L濃度稀釋，常溫下孵育5 min，最后與轉染試劑等體積分別混勻，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后，觀察轉染細胞狀態(tài)，并將無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，提取細胞RNA，驗證轉染效率。實驗分為慢病毒轉染實驗組和空白病毒轉染組，轉染si-ATB為實驗組，轉染空白慢病毒為對照組。

1.4 定量實時PCR分析 定量實時聚合酶鏈式反應反應條件為：95℃預變性10 min，95℃15 s，60℃15 s，45個循環(huán)，獲取熒光信號溫度為60℃。普通DNA PCR檢測，以GAPDH為內參，采用2-△△Ct方法進行統(tǒng)計。ATB序列：正向5’-AAATATGGCGGCGTCTA CACGGA-3’，反向5’-TCCAGAACCCTCTGACATTTGCCT-3’；miR-144引物序列：正向5’-AATCAGAGTACATGCGACTGAGA-3’， 反向5’-GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC-3’。

1.5 平板克隆細胞實驗 首先消化并計數(shù)細胞，以5 000個/孔細胞數(shù)接種于96孔板中，每組3個復孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；待細胞貼壁，觀察細胞狀態(tài)，吸出培養(yǎng)基，避光條件下，分別加入慢病毒轉染的細胞中，37℃孵育24 h；檢測不同組細胞的克隆形成數(shù)目，并統(tǒng)計分析。

1.6 Transwell侵襲實驗 將5×104個轉染慢病毒后的細胞置于上室，并加入Matrigel基質膠，將10%FBS的培養(yǎng)基置于下室中。在37℃下孵育24 h后，細心去除上膜表面的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈后，于倒置顯微鏡下計數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 ATB基因野生型3’UTR、突變型3’UTR片段，兩端均設計XbaⅠ酶切位點，插入熒光素酶基因質粒構建 pGL3-3’UTR野生型(wild type，wt)、pGL3-3’UTR突變型(mutant type，mut)， 取生長狀態(tài)良好的細胞，質粒轉染后48 h根據(jù)操作說明，裂解細胞，加入熒光素酶底物，檢測熒光素酶活性。

1.8 裸鼠腫瘤異種移植模型 將si-ATB組和對照組U87細胞按1×106/孔濃度分別注射到4～6周齡裸鼠的腋窩下。飼養(yǎng)8周后檢測兩組裸鼠異種移植物的體積和質量生長情況。

2 結果

2.1 lncRNA ATB在膠質瘤組織中表達及和生存率之間的關系 通過qPCR檢測lncRNA ATB在膠質瘤組織中和癌旁正常組織中的表達差異，癌組織中l(wèi)ncRNA ATB的相對表達量高于癌旁正常組織[(3.84±0.32)比(1.21±0.15)，t=12.670,P=0.003]。同時對患者進行隨訪，通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA ATB的表達水平與膠質瘤患者的生存情況相關(χ2=9.348，P=0.016)，見圖1。

圖1 lncRNA ATB表達水平與膠質瘤患者的生存情況分析

2.2 lncRNA ATB在細胞株中的表達水平及慢病毒轉染情況 通過qPCR實驗檢測lncRNA ATB在不同膠質瘤細胞株中的表達情況，結果顯示，lncRNA ATB在U87細胞株表達水平相對升高，與其他細胞株相比，表達水平差異有統(tǒng)計學意義[(2.12±0.32)比(3.36±0.35)比(1.26±0.23)比(0.86±0.11)，t=12.516,P=0.023；t=14.112,P=0.011；t=11.957,P=0.005]。通過使用si-ATB1和si-ATB2轉染膠質瘤U87和U251細胞后，lncRNA ATB的相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義[U521si-ATB1:(1.01±0.02)比(0.56±0.02)，t=23.029，P=0.005；U521si-ATB2:(1.01±0.02)比(0.43±0.01)，t=43.078，P=0.003；U87si-ATB1:(1.03±0.01)比(0.44±0.02)，t=46.561，P=0.003；U87si-ATB2:(1.03±0.01)比(0.49±0.03)，t=37.912，P=0.004]。

2.3 雙熒光素酶實驗檢測lncRNA ATB和miR-144之間的關系 通過檢測到lncRNA ATB與miR-144具有相似的結合位點，兩者可能存在內在調控關聯(lián)。為進一步驗證lncRNA ATB與miR-144之間的聯(lián)系，通過雙熒光素酶實驗進行檢測。過表達miR-144后，野生型lncRNA ATB的熒光素酶活性受到明顯抑制[(1.95±0.05)比(0.83±0.15)，t=37.064，P=0.002]，而對突變型lncRNA ATB的熒光素酶活性影響不大[(1.93±0.02)比(2.01±0.05)，t=1.752，P=0.149]，顯示miR-144可以直接與lncRNA ATB結合位點結合并影響熒光素酶活性。

2.4 ATB對細胞株增殖能力的影響 通過平板克隆實驗檢測lncRNA ATB對膠質瘤細胞株U87和U251增殖能力的影響。首先使用特異的干擾RNA(si-ATB)抑制膠質瘤細胞中l(wèi)ncRNA ATB的表達，在轉染si-ATB 24、48和72 h后，U87和U251細胞的增殖能力低于各自對照組[U521si-ATB1:(0.56±0.05)個 比(0.23±0.02)個，t=34.762，P=0.003；U521si-ATB2:(0.56±0.05)個 比(0.19±0.04)個，t=48.180，P=0.002；U87si-ATB1:(0.50±0.06)個 比(0.18±0.02)個，t=51.309，P<0.001；U87si-ATB2:(0.50±0.06)個 比(0.21±0.05)個，t=39.030，P=0.003]。詳見圖2。

圖2 lncRNA ATB對膠質瘤細胞U87和U251增殖能力的影響

2.5 lncRNA ATB對膠質瘤細胞株凋亡行為的影響 用流式細胞術檢測lncRNA ATB對膠質瘤細胞凋亡的影響。lncRNA ATB的下調提高了U251[(14.2±0.5)% 比 (7.2±0.4)%比(4.6±0.3)%；t=13.324、P=0.0347，t=10.471、P<0.001]和U87[(13.9±0.7)% 比 (10.1±0.3)% 比 (5.6±0.4)%；t=14.760、P=0.033，t=16.682、P=0.002]凋亡百分比。詳見圖3。

2.6 lncRNA ATB對細胞株侵襲能力的影響 抑制lncRNA ATB 72 h后，U251細胞[(186.4±12.4)個 比 (73.6±8.6)個 比 (62.6±5.6)個；t=10.269、P<0.001，t=11.587、P=0.001]和U87細胞[(192.2±15.3)個 比(63.6±6.3)個 比(68.3±7.6)個；t=14.432、P<0.001，t=13.783、P<0.001]的侵襲能力降低。詳見圖4。

2.7 lncRNA ATB對裸鼠移植瘤的影響情況 通過裸鼠異種移植腫瘤生長測定移植瘤體積和質量情況。將si-ATB轉染的U87細胞分別注射入裸鼠，在注射后28 天，將小鼠處死并取腫瘤。與對照組相比，si-ATB組平均腫瘤體積小于對照組[(846.3±26.3)mm3比 (306.5±19.9)mm3,t=15.332,P<0.001]，且si-ATB組平均腫瘤質量也低于對照組[(0.62±0.23)g 比 (1.52±0.24)g,t=10.580,P<0.001]。詳見圖5。

圖3 lncRNA ATB對膠質瘤細胞U87和U251凋亡的影響

圖4 lncRNA ATB對膠質瘤細胞株侵襲能力的影響

圖5 lncRNA ATB對膠質瘤細胞裸鼠成瘤模型的影響

3 討論

lncRNA ATB作為癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中的關鍵調控分子[12-13]，其可能會成為膠質瘤最有潛力的治療靶點。lncRNA作為一種新型腫瘤標志物，檢測血循環(huán)中RNA已成為非侵入性診斷應用的新方向[14]。然而，目前關于早期檢測膠質瘤患者血循環(huán)中l(wèi)ncRNA水平的研究較少，本研究就此開展此項實驗。

有報道指出，lncRNA ATB在乳腺癌，結、直腸癌，食管鱗狀細胞癌中上調，并且促進腫瘤侵襲和轉移以及影響生存率[15]。本研究首次證明了lncRNA ATB在膠質瘤中的調控方式，并揭示lncRNA ATB表達與膠質瘤的侵襲性生物學行為相關，同時在動物體內檢測lncRNA ATB的表達下調可以直接影響膠質瘤細胞的成瘤能力。此外，lncRNA ATB表達高的患者的淋巴結轉移多，晚期和組織學分化程度高于lncRNA ATB表達低的患者[13]。

lncRNA ATB在體外調節(jié)多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡[13]。lncRNA ATB在乳腺癌細胞中的表達促進了細胞侵襲，lncRNA ATB的敲低降低了乳腺癌細胞侵襲能力，同時抑制了細胞生長，調節(jié)了細胞周期進程并誘導細胞凋亡，并且在多種腫瘤組織中都存在lncRNA ATB的表達異常[15-17]。本實驗證實siRNA介導的ATB導致膠質瘤細胞增殖、集落形成效率和侵襲能力顯著降低及細胞凋亡顯著增加，推測lncRNA ATB調控miR-144的表達影響膠質瘤的發(fā)展。

本研究表明，lncRNA ATB在膠質瘤患者中存在過表達狀態(tài)，且在一定程度上表明預后差，通過誘導腫瘤細胞增殖和侵襲并減少癌細胞凋亡來促進腫瘤的發(fā)展。此外，lncRNA ATB可能通過靶向調控miR-144的表達參與下游信號通路的介導，lncRNA可能是未來膠質瘤治療中有價值的預測標志和新的治療靶標。