徐占領(lǐng)

0 引言

進(jìn)入本世紀(jì)以來，隨著我國老齡化進(jìn)程的加快，高血壓的發(fā)病率一直居高不下，甚至出現(xiàn)逐年上升的趨勢。國外有研究顯示，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)與心腦血管疾病尤其是高血壓的發(fā)生密切相關(guān)[1]?！吨袊哐獕悍乐沃改?010版》中也指出，Hcy是誘發(fā)心腦血管疾病發(fā)生的新的危險(xiǎn)因素[2]。因此，有研究者將人體血漿Hcy>10 μmol/L的高血壓患者定義為H型高血壓[3]。對于H型高血壓患者的治療，應(yīng)在控制血壓的同時(shí)，強(qiáng)調(diào)降低其Hcy水平。亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylene tetrahydmfolate reductase，MTHFR)是Hcy代謝過程中的一種關(guān)鍵酶，可促使5,10-MTHF轉(zhuǎn)化為 5-MTHF，參與Hcy再甲基化過程[4]。因此，當(dāng)MTHFR發(fā)生遺傳缺陷時(shí)，血漿Hcy水平會異常升高。近年來，隨著醫(yī)學(xué)水平的發(fā)展，從遺傳學(xué)角度探討基因突變與高血壓發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性已經(jīng)成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有研究顯示，我國人群MTHFR基因C667T遺傳突變率較高，在環(huán)境和遺傳雙重因素的影響下，我國75%以上的高血壓患者都屬于H型高血壓[5]，因此，探討MTHFR基因C667T單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與降壓藥物療效之間的關(guān)系，對于采取個(gè)體化治療具有重要的臨床價(jià)值。阿托伐他汀鈣屬于新型羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，研究顯示，阿托伐他汀鈣可能通過降低血清Hcy濃度發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用[6]。本研究旨在探討H型高血壓患者接受阿托伐他汀鈣治療后血漿Hcy的變化，及其與MTHFR C667T基因多態(tài)性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月至2017年10月在我院心內(nèi)科住院或門診就診的H型高血壓患者476例，其中男257例，女219例；年齡39～81歲，平均年齡(58.67±8.19)歲。采集血液樣本測定Hcy含量，所有患者Hcy≥10 μmol/L。按照隨機(jī)數(shù)字表法，將患者分為對照組(212例)和觀察組(264例)。兩組患者的年齡、性別比例、平均病程、體重指數(shù)(Body mass index，BMI)、平均收縮壓(Systolic blood pressure，SBP)、平均舒張壓(Diastolic blood pressure，DBP)等一般臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本項(xiàng)研究已獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。見表1。

1.2 受試者入選標(biāo)準(zhǔn) ①所有患者均符合《中國高血壓防治指南2010版》關(guān)于原發(fā)性高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)：收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg；②所有患者遵循自愿原則，并簽署知情同意書。

1.3 受試者排除標(biāo)準(zhǔn) ①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的受試者；②合并惡性腫瘤者；③合并器質(zhì)性心臟病變者；④合并有血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病或急性感染者；⑤合并其他嚴(yán)重疾病者；⑥受試前1個(gè)月內(nèi)服用葉酸、維生素B及其他影響維生素代謝的藥物者；⑦受試前1個(gè)月服用他汀類藥物者等。

1.4 治療方案 所有患者采用常規(guī)降壓藥物治療，包括鈣離子拮抗劑、β受體阻斷劑、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、AT1受體拮抗劑等。觀察組患者在常規(guī)降壓藥物治療的基礎(chǔ)上加服阿托伐他汀鈣(立普妥，輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20051407，10 mg/片) 20 mg/次，1次/d。連續(xù)治療12周。

1.5 研究方法

1.5.1 樣本采集 采集所有受試者清晨空腹時(shí)的外周靜脈血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二鈉(EDTA-Na)抗凝劑的采血管中，用于檢測生化指標(biāo)；其余血液樣本于-70 ℃低溫保存，用于進(jìn)行DNA提取。

1.5.2 血壓測量 所有患者均在每日8∶00～22∶00采用歐姆龍醫(yī)用電子血壓計(jì)測量坐位血壓，每日測量3次，取平均值。

1.5.3 生化指標(biāo)檢測 由我院檢驗(yàn)科采用邁瑞B(yǎng)S350全自動血液生化分析儀(中國邁瑞)檢測患者血糖、血脂、Hcy等生化指標(biāo)。△Hcy=治療前Hcy水平-治療后Hcy水平。

1.5.4 引物設(shè)計(jì)與合成方法 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的資料設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。見表2。

1.5.5 MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測方法 ①DNA提取：采用基因組DNA小量抽提試劑盒(由北京天根生物技術(shù)有限公司提供)。具體提取方法參照說明書進(jìn)行。②采用紫外分光光度法測定DNA質(zhì)量和濃度。③進(jìn)行PCR-RELP：取8 μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μl 10×Buffer和1 μl特異性限制性內(nèi)切酶(購自大連寶生生物工程有限公司)，然后加入9 μl去離子水，于37 ℃反應(yīng)12～14 h。④將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。⑤基因測序：將50 μl測序樣品送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化測序；確定為目的片段后，進(jìn)行大批量擴(kuò)增，電泳，酶切，確定基因型。

表1 患者一般臨床資料(例)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，每一等位基因出現(xiàn)的頻率采用直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)算；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的數(shù)據(jù)比較；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic多元回歸分析確定MTHFR基因多態(tài)性與Hcy水平的關(guān)系。并采用系列模型校正相關(guān)危險(xiǎn)因素，其中以單因素回歸中P<0.05的指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)選擇協(xié)變量建立線性回歸模型。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異檢驗(yàn)均為雙側(cè)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者生化指標(biāo)比較 兩組患者總膽固醇水平、三酰甘油、空腹血糖值及Hcy水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表3。

2.2 兩組患者M(jìn)THFR C677T基因型及等位基因分布頻率比較 觀察組患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性分布頻率為21.97%CC、47.73%CT、30.30%TT，對照組為23.11%CC、46.70%CT、30.19%TT，兩組患者均以雜合型CT型為最多見；觀察組患者等位基因頻率分別為45.83% C、54.17% T，對照組為46.46% C、53.54% T，其中以等位基因T為最多見。兩組患者M(jìn)THFR C677T多態(tài)性的基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

2.3 不同基因型H型高血壓患者治療前后血漿Hcy水平 治療前，兩組TT型高血壓患者血漿Hcy水平高于CC型和CT型患者(P<0.05)；治療12周后，兩組3種不同基因型患者平均血漿Hcy水平均降低(P<0.05)。其中兩組TT型患者平均血漿Hcy水平仍然高于CC型和CT型患者(P<0.05)；但是觀察組TT型患者Hcy下降幅度大于CC型和CT型患者(P<0.05)；而對照組3種基因型患者Hcy下降幅度基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

2.4 MTHFR基因單倍體型與阿托伐他汀鈣對Hcy水平降低作用的相關(guān)性 經(jīng)單因素Logistic回歸分析顯示，MTHFR基因C677T位點(diǎn)突變型TT及阿托伐他汀治療是影響Hcy變化量的因素(OR=1.114，95%CI:1.068～1.372，P<0.05；OR=0.897，95%CI:0.635～0.912，P<0.05)。此外，為了排除各種因素對Hcy變化量的影響，筆者采用系列模型進(jìn)行校正，包括模型1(校正了年齡、性別、病程、BMI)、模型2(校正了SBP、DBP、總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy)。最終，以單因素分析中P<0.05的變量作為協(xié)變量構(gòu)建模型3。經(jīng)多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，校正其他獨(dú)立危險(xiǎn)因素，MTHFR C677T基因位點(diǎn)TT型突變和是否加服阿托伐他汀鈣對于降低H型高血壓患者血漿Hcy水平具有交互作用(P<0.05)。見表6。

表2 MTHFRC677T基因SNPs分析

表3 兩組患者生化指標(biāo)比較(mmol/L)

表4 MTHFR C677T基因多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布(例，%)

3 討論

目前，心腦血管疾病已經(jīng)成為全球性問題，而高血壓是心腦血管疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。高血壓的發(fā)病因素復(fù)雜且多樣化，大量研究顯示，血漿Hcy水平升高是高血壓發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7]。目前國際上將Hcy>10 μmol/L的原發(fā)性高血壓患者定義為H型高血壓。在我國，高血壓患者血漿Hcy水平普遍高于國外高血壓患者的平均水平，因此，大部分原發(fā)性高血壓患者均伴有高Hcy血癥，尤其是男性高血壓人群中，H型高血壓患者的比例甚至高達(dá)90%以上[8]，據(jù)推測可能的原因包括環(huán)境因素、飲食習(xí)慣及遺傳因素等。Hcy并非自身合成，而是主要來源于食物中攝取的蛋白質(zhì)，是蛋氨酸水解過程中的中間產(chǎn)物，其中亞甲基四氫葉酸還原酶與Hcy代謝密切相關(guān)[9]。有研究顯示，我國人群MTHFR C677T TT基因攜帶率較高，對代謝酶的活性影響較大，血漿Hcy的整體水平相對偏高[10]。因此，有效地控制血漿Hcy水平對于降低心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

目前，在我國臨床上主要采取鈣離子拮抗劑、β受體阻斷劑、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、AT1受體拮抗劑等進(jìn)行降壓治療，但是對于血漿Hcy水平的改善作用并不明顯。阿托伐他汀鈣是一種新型的人工合成的降壓調(diào)脂藥物，對血管內(nèi)皮功能有明顯的改善作用[11]。研究顯示，阿托伐他汀鈣可降低血漿Hcy水平以及Hcy引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而保護(hù)血管內(nèi)皮[12]。而MTHFR基因是H型高血壓疾病遺傳易感性的重要基因，其是否與阿托伐他汀鈣降低Hcy水平有密切關(guān)系是本項(xiàng)研究的主要目的。

表5 兩組不同基因型患者治療前后血漿Hcy水平(μmol/L)

注：*與突變型TT組比較，P<0.05

表6 經(jīng)多元Logistic回歸分析MTHFR基因型與Hcy水平變化的相關(guān)性(△Hcy作為因變量)

注：模型1，校正了年齡、性別、病程、BMI；模型2，校正了SBP、DBP、總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy；模型3，校正了年齡、性別、病程、BMI、SBP、DBP、總膽固醇、三酰甘油、空腹血糖、Hcy

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是基因組計(jì)劃和后基因組計(jì)劃研究工作的深入開展，為探討高血壓個(gè)體化治療的遺傳學(xué)機(jī)制提供了新的思路和方法。1995年，由Frosst等[13]學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T配體結(jié)合域存在功能性氨基酸變異現(xiàn)象，可影響Hcy代謝酶的活性，MTHFR C677T突變是目前發(fā)現(xiàn)的MTHFR基因最常見的不耐熱突變位點(diǎn)。有研究證實(shí)，MTHFR C677T基因CT型和TT型酶活性較CC基因型明顯降低，從而導(dǎo)致血漿Hcy水平升高[14-15]。基于前期報(bào)道，本項(xiàng)研究著重探討了MTHFR C677T基因多態(tài)性與阿托伐他汀鈣對H型高血壓患者血漿Hcy降低作用的相關(guān)性。結(jié)果顯示，治療前，TT型患者血漿Hcy水平高于CC型、CT型患者，提示H型高血壓人群中MTHFR基因677C/T純合突變TT基因型可能是Hcy升高的重要遺傳因素。H型高血壓患者接受阿托伐他汀鈣治療后，血漿Hcy水平明顯降低，尤其是TT型患者血漿Hcy水平降低最為明顯，與CC型、CT型患者血漿Hcy平均降低幅度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)二元Logistic回歸分析，MTHFR C677T基因位點(diǎn)TT型突變是阿托伐他汀鈣降低H型高血壓患者血漿Hcy水平的重要影響因素。

由于H型高血壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且與遺傳因素密切相關(guān)，不同種族、地區(qū)的人群基因背景也不甚相同，所以MTHFR C677T基因多態(tài)性與降壓藥物療效的相關(guān)性尚待進(jìn)一步確證。但是本研究在一定程度上反映了阿托伐他汀鈣對于攜帶有MTHFR C677T基因位點(diǎn)TT型突變的H型高血壓患者的血漿Hcy水平有明顯的降低作用，從而為H型高血壓患者的個(gè)體化治療提供了一定的證據(jù)支持。