張洪海

0 引言

近年來，抗腫瘤新藥的研究已經成為腫瘤研究的新熱點，其中天然化合物因其高效低毒的特性在腫瘤藥物治療研究中日益受到關注[1-4]。莪術油提取于姜科植物蓬莪術、廣西莪術、溫郁金的干燥根莖中，目前研究發(fā)現，其具有抗病毒、抗炎及治療潰瘍等功效[5-7]。吉馬酮(Germacrone)是莪術油的主要有效成分之一，是一種單環(huán)倍半萜類天然化合物。近年來的藥物研究發(fā)現，吉馬酮具有明顯的抗腫瘤作用，對肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，并且具備低毒高效等特點[8-9]，但其在肺癌中的相關抗腫瘤研究并不多，且抗腫瘤作用機制不完全明確。本研究通過培養(yǎng)人大細胞肺癌NCI-H460細胞進行吉馬酮的體外抗腫瘤實驗，目的是明確吉馬酮對人大細胞肺癌NCI-H460細胞是否有抑制作用，并通過熒光電子顯微鏡及流式細胞儀等實驗研究方法對其抗腫瘤機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人大細胞肺癌NCI-H460細胞購自中國科學院上海細胞庫；吉馬酮：中國藥品生物制品檢定所；RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清：美國GIBCO公司；0.25%胰蛋白酶：美國康寧公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)：南京凱基公司；二甲基亞楓(DMSO)：南京凱基公司； AnnexinV/PI雙染試劑盒：南京凱基公司；流式細胞儀:美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) NCI-H460細胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃、飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長,每48小時胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 消化并收集對數生長期的NCI-H460細胞，用培養(yǎng)液調整濃度至1×105/ml，96孔板中每孔接種100 μl細胞懸液，待過夜貼壁良好后更換培養(yǎng)液，依次加入含濃度為50、100、200、400 μmol/L吉馬酮的培養(yǎng)液，實驗同時設有對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加MTT 20 μl，再培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μl振蕩混勻，酶標儀檢測并計算細胞的增殖抑制率，實驗重復3次。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察NCI-H460細胞形態(tài) 消化并收集對數生長期的細胞，用培養(yǎng)液調整濃度至5×105/ml，6孔板中每孔接種2 ml細胞懸液，待過夜貼壁良好后更換培養(yǎng)液，依次加入含濃度為0、400 μmol/L吉馬酮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗2次，吹干，固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)固定15 min，PBS洗后加入濃度為5 mg/L的Hoechst 33342溶液1 ml，37 ℃避光15 min，應用熒光顯微鏡觀察并照相，實驗重復3次。

1.2.4 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡 消化并收集對數生長期的細胞，用培養(yǎng)液調整濃度至5×105/ml，6孔板中每孔接種2 ml細胞懸液，待過夜貼壁良好后更換培養(yǎng)液，依次加入含濃度為0、200、400 μmol/L吉馬酮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化收集細胞后4 ℃、1 000 r/min離心10 min，PBS洗滌離心細胞2次。1×Binding Buffer 500 μl懸浮細胞，調整細胞濃度為1×106/ml。5 μl AnnexinV-FITC加入細胞懸浮液中混勻，再加入5 μl PI混勻避光15 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數據應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 吉馬酮對NCI-H460細胞增殖的影響 MTT實驗顯示，吉馬酮可以抑制NCI-H460細胞的增殖，并且隨著吉馬酮濃度的增大對細胞的抑制作用更加明顯，呈濃度效應關系(P<0.05)(圖1)。

2.2 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡改變 熒光顯微鏡觀察結果顯示，吉馬酮作用組的細胞數量明顯減少，細胞核的形態(tài)變化顯著，出現染色質邊集、核碎裂等凋亡改變(圖2)。

圖1 吉馬酮對人大細胞肺癌細胞系NCI-H460細胞增殖的抑制作用

圖2 熒光顯微鏡觀察NCI-H460細胞凋亡形態(tài)改變

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組相比，隨著藥物濃度的增大，凋亡細胞的比例逐漸增加，呈現濃度效應關系。見圖3。

3 討論

目前，肺癌仍占惡性腫瘤患者死亡率的首位。近年來，人們采取了化學治療等來治療中晚期肺癌，但由于化療的毒副作用及耐藥等問題，對肺癌生存率的提高影響較小[10]。近年來的研究發(fā)現，一些天然化合物具有抗腫瘤作用，并表現出低毒高效等特點，目前在腫瘤治療研究中已受到重視[1-4]。天然化合物的抗腫瘤作用是目前肺癌治療研究的重要內容之一。

圖3 吉馬酮誘導NCI-H460細胞凋亡

本研究選取的天然化合物吉馬酮是從中藥姜科姜黃屬植物莪術根莖中提取的天然化學成分，具有抗病毒、抗炎、抗菌等藥理作用[11-12]。近年來的藥理實驗研究發(fā)現，吉馬酮具有明顯的抗腫瘤作用，對肝癌細胞、乳腺癌細胞及膠質瘤細胞等多種腫瘤細胞具有抑制作用，并且具備低毒高效等特點[8-9]。但吉馬酮在肺癌中的相關抗腫瘤研究并不多，且抗腫瘤作用機制不完全明確。本研究通過培養(yǎng)人大細胞肺癌NCI-H460細胞進行體外抗腫瘤實驗，通過MTT、熒光電子顯微鏡及流式細胞儀等實驗研究方法研究吉馬酮對人大細胞肺癌NCI-H460細胞的抑制作用及其抗腫瘤機制。實驗結果證明，吉馬酮可以抑制人大細胞肺癌細胞系NCI-H460細胞的增殖，并呈濃度依賴關系。熒光顯微鏡觀察到藥物作用組細胞核出現染色質邊集、核碎裂等凋亡改變，流式細胞儀檢測到，隨著藥物濃度的增加，凋亡率隨之增大，證實了吉馬酮對人大細胞肺癌細胞有抑制作用，其機制與誘導細胞凋亡有關。

綜上所述，吉馬酮對人大細胞肺癌NCI-H460細胞有明顯的抑制作用，為吉馬酮在治療大細胞肺癌方面提供了部分實驗依據，但仍需動物體內實驗研究，以進一步評估其體內抗腫瘤效果。