劉秀菊

（廣東省深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518000）

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）是一種水解酶，在堿性環(huán)境中能水解很多磷酸單酯化合物。該酶的用途廣泛，它可以作為某些疾病的標(biāo)志物，也經(jīng)常用于在酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 中標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)而幫助檢測相應(yīng)的抗原或抗體的含量。堿性磷酸酶的酶學(xué)性質(zhì)已經(jīng)得到廣泛研究，如從不同物種中提取此酶，研究它的Km和Vmax值、最適pH和最適反應(yīng)溫度等基本性質(zhì)，從而比較不同物種之間堿性磷酸酶的差異[1-3]。但是對堿性磷酸酶活性的其他影響因素（如緩沖液、NaN3、聚乙二醇等）研究較少。另外，這些實(shí)驗(yàn)多采用分光光度法跟蹤堿性磷酸酶催化對硝基苯酚磷酸鹽在水溶液中水解生成對硝基苯酚的反應(yīng)，都是基于產(chǎn)物在水溶液中的摩爾吸光系數(shù)不變的情況下來測定酶的活性。不同種類、濃度和pH的緩沖溶液對產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)影響很大，這直接影響到文獻(xiàn)中有關(guān)堿性磷酸酶活性研究的準(zhǔn)確性，因此有必要進(jìn)行報道。

急性心肌梗死是一種發(fā)病率和死亡率很高的疾病。它的常用標(biāo)志物有肌紅蛋白、肌酸激酶、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponins,cTn）I、T，C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein,CRP）等。其中，cTnI是當(dāng)今公認(rèn)的“黃金標(biāo)志物”。2000年，歐洲心臟病學(xué)會和美國心臟病學(xué)會進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了cTn家族（I、T）的檢測對于急性心肌梗死的確診是十分必要的[4-5]。CRP的用途非常廣泛，它不僅可以用于診斷心肌梗死，還常用于各種慢性感染、組織損傷、惡性腫瘤、風(fēng)濕及手術(shù)創(chuàng)傷等疾病的輔助診斷和治療檢測[6]。因此，對cTnI和CRP的定量檢測備受重視。

本文分析了不同緩沖液、疊氮化鈉（NaN3）、聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）對AP酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響，并且建立了堿性磷酸酶的心肌梗死標(biāo)志物cTnI、CRP的雙抗體夾心式ELISA檢測體系，為堿性磷酸酶的實(shí)際應(yīng)用提供有價值的信息。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

小牛腸堿性磷酸酶（30 u/μl）購于寶生物工程(大連)有限公司，對硝基苯酚磷酸二鈉（p-nitrophenyl phosphate hexahydrate disodium,PNPP）購于美國Amresco公司，cTnI質(zhì)控品和CRP標(biāo)準(zhǔn)品以及cTnI的抗體（檢測抗體16A11、包被抗體19C7）購于芬蘭Hytest公司，CRP抗體（檢測抗體4C28C6、包被抗體4C28C2）購于美國International Immunology Corporation公司，用于去除酶-抗體結(jié)合物中游離酶的試劑盒（FreeZyme Conjugate Purification Kit）、脫鹽柱（D-Salt Polyacrylamide 6000 Desalting Columns）、用于合成酶-抗體結(jié)合物的交聯(lián)劑LC-SMCC（Succinimidyl-4-［N-Maleimidomethyl］cyclohexane-1-carboxy-［6-amidocaproate］）以及β-巰基乙胺（β-mercaptoethylamine，MEA）購于美國的Pierce公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

ELISA試劑：包被液TBS（0.025 M Tris,0.15 M NaCl，pH 7.4），封閉液TBS+1% BSA（w/v），稀釋液TBS+0.5% BSA（w/v）+0.05%吐溫20（v/ v），洗滌液TBS+0.05%吐溫20（v/v），終止液1 M NaOH。

1.2 對硝基苯酚摩爾吸光系數(shù)的測定

對硝基苯酚（p-nitrophenol,PNP）是在堿性磷酸酶催化下底物PNPP的水解產(chǎn)物，該產(chǎn)物呈黃色，在405 nm處有強(qiáng)烈吸收。本研究選用了5種常用的緩沖液：碳酸鈉/碳酸氫鈉（Na2CO3/NaHCO3）緩沖液（0.1 M，pH 9.8），三羥甲基氨基甲烷/鹽酸（Tris/HCl）緩沖液（0.05 M，pH 9.8），巴比妥鈉／鹽酸緩沖液（0.1 M，pH 9.8），硼砂/氫氧化鈉（Na2B4O7/NaOH）緩沖液（0.05 M，pH 9.8），二乙醇胺（DEA）/鹽酸緩沖液（1.0 M，pH 9.8）。將PNP溶解在這5種緩沖液中，配成濃度為1、2.5、5、7.5、10 μM的溶液，測其在405 nm處的吸光度。以PNP溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，所得斜率即為產(chǎn)物在該緩沖溶液中的摩爾吸光系數(shù)。本文還研究了不同濃度和pH的DEA緩沖液對PNP摩爾吸光系數(shù)的影 響。

1.3 堿性磷酸酶活性的研究

在2.5 ml的反應(yīng)體系中，緩沖液2.025 ml，底物PNPP（100 mM）0.375 ml，堿性磷酸酶（30 mu）0.1 ml，pH為9.8，在37℃下，測定405 nm處的吸光度變化，通過上述體系，研究緩沖液、pH、NaN3、PEG對酶促反應(yīng)的影響，并測定其動力學(xué)常數(shù)。

1.4 PEG對堿性磷酸酶穩(wěn)定性影響的研究

將堿性磷酸酶液和PEG混合，使PEG在酶液的濃度為100 mg/ml，50℃水浴，每隔一定時間取出0.1 ml混合液，參考1.3的反應(yīng)體系，測堿性磷酸酶活性，比較該酶在50℃的活性變化及不同分子量的PEG對其穩(wěn)定性的影響。

1.5 堿性磷酸酶在檢測cTnI和CRP的雙抗體夾心式ELISA中的應(yīng)用

1.5.1 堿性磷酸酶-抗體結(jié)合物的制備 堿性磷酸酶（25 u/μl，20 μl）和 LC-SMCC（50 mg/ ml，10 μl）混合，室溫反應(yīng)1 h，形成被活化的酶，過脫鹽柱，去除多余的LC-SMCC，收集被活化的酶?？贵w（11.3 mg/ml，0.09 ml）和MEA（250 mg/ ml，10 μl）混合以生成Fab，室溫反應(yīng)1 h后，過脫鹽柱，去除多余的MEA，收集Fab組分。將被活化的酶和Fab組分按一定摩爾比（標(biāo)記cTnI和CRP抗體的摩爾比分別為4︰1和1︰1）混合以合成酶-抗體結(jié)合物，4℃過夜后，用FreeZyme Conjugate Purification Kit去除游離酶，將收集到的酶-抗體結(jié)合物保存于該試劑盒提供的貯存緩沖液，并與等量的乙二醇混勻，置于-20℃冰箱中保存。

1.5.2 檢測cTnI和CRP的雙抗體夾心式ELISA方法的建立及性能評價 建立檢測cTnI和CRP的ELISA檢測體系。采用棋盤法，進(jìn)行以下條件的篩選：包被抗體濃度（1、5、10、100 μg/ml），封閉液濃度（0.1%、0.5%、1%、3%、5%BSA溶液），cTnI酶-抗體結(jié)合物稀釋度（1︰10、1︰20、1︰100、1︰1 000），CRP酶-抗體結(jié)合物稀釋度（1︰100、1︰1 000、1︰2 000、1︰5 000），PNPP 濃度（10、100 mM），酶與底物作用時間（10、20、30、50 min）。選擇不同濃度梯度的cTnI和CRP，以cTnI或CRP濃度為橫坐標(biāo)，在405 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定該方法的靈敏度、線性范圍、穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 緩沖液的種類、濃度和pH對產(chǎn)物摩爾吸光系數(shù)的影響

緩沖液的種類、濃度和pH對PNP的摩爾吸光系數(shù)都有一定的影響，而且產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)隨溶液的濃度增加而增加，也隨溶液的pH增加而增加。見表1。

表1 緩沖液的種類、濃度和pH對PNP摩爾吸光系數(shù)的影響

2.2 不同緩沖液對酶促反應(yīng)速度的影響

研究表明，堿性磷酸酶在這5種緩沖液顯示不同的反應(yīng)活性。在DEA緩沖液中的酶促反應(yīng)速度最高。其他4種緩沖液中的反應(yīng)速度僅能達(dá)到DEA緩沖液中的45%～62%。見圖1。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，均選用DEA緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)。

圖1 不同緩沖溶液對堿性磷酸酶的影響

2.3 NaN3對酶反應(yīng)速度的影響

在反應(yīng)體系中添加NaN3使其終濃度為5～30 mM，結(jié)果表明NaN3對堿性磷酸酶動力學(xué)常數(shù)Km和Vmax沒有明顯影響，證實(shí)堿性磷酸酶保存液中的NaN3作為防腐劑不影響酶的活性。

2.4 聚乙二醇對酶活性和穩(wěn)定性的影響

PEG對堿性磷酸酶的動力學(xué)常數(shù)沒有明顯影響，但是不同分子量的PEG都能使酶的穩(wěn)定性有一定的提高，如圖2所示。但其穩(wěn)定化作用與PEG的分子量沒有明顯的直接關(guān)系。見圖2。

圖2 PEG對堿性磷酸酶熱穩(wěn)定性的影響

2.5 堿性磷酸酶在檢測cTnI和CRP的ELISA中的應(yīng)用

檢測cTnI的ELISA檢測體系的最適條件為：包被抗體為10 μg/ml，封閉液為1%BSA，檢測抗體-酶稀釋度為1︰20，底物PNPP為10 mM，底物和酶作用時間為20 min。線性范圍為0.45～75.2 ng/ml，批內(nèi)變異系數(shù)≤4.74%，批間變異系數(shù)≤9.21%。檢測CRP的ELISA檢測體系的最適條件為：包被抗體為10 μg/ml，封閉液為1%BSA，檢測抗體-酶稀釋度為1︰5 000，底物PNPP為10 mM，底物和酶作用時間為20 min。線性范圍為5～100 ng/ml。批內(nèi)變異系數(shù)≤7.745%，批間變異系數(shù)≤11.73。見圖3。

圖3 檢測cTnI和CRP的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

堿性磷酸酶是一種堿性水解酶，用途非常廣泛，它可以作為某些疾病的標(biāo)志物[4-5]，也經(jīng)常被用于在ELISA中標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)而幫助檢測相應(yīng)的抗原或抗體的含量[6-7]。堿性磷酸酶的酶學(xué)性質(zhì)已經(jīng)得到廣泛研究，但是對堿性磷酸酶活性的其他影響因素（如緩沖液、NaN3、聚乙二醇等）研究較少[8-10]。另外，這些實(shí)驗(yàn)多采用分光光度法跟蹤堿性磷酸酶催化對硝基苯酚磷酸鹽在水溶液中水解生成對硝基苯酚的反應(yīng)，都是基于產(chǎn)物在水溶液中的摩爾吸光系數(shù)不變的情況下來測定酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，不同種類、不同濃度和不同pH的緩沖溶液對產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)影響很大，這直接影響到文獻(xiàn)中有關(guān)堿性磷酸酶活性研究的準(zhǔn)確性。

急性心肌梗死是一種發(fā)病率和死亡率很高的疾病。當(dāng)今公認(rèn)的“黃金標(biāo)志物”是心肌肌鈣蛋白（cardiac troponins I,cTnI）。2000年歐洲心臟病學(xué)會和美國心臟病學(xué)會進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了cTn家族（I、T）的檢測對于急性心肌梗死的確診是十分必要的[11-12]。CRP的用途非常廣泛，它不僅可以用于診斷心肌梗死，還常用于各種慢性感染、組織損傷、惡性腫瘤、風(fēng)濕、手術(shù)創(chuàng)傷等疾病的輔助診斷和治療檢測[13]。因此，對cTnI和CRP的定量檢測備受重視。

堿性磷酸酶的酶促反應(yīng)試驗(yàn)中，產(chǎn)物PNP的摩爾吸光系數(shù)多采用一個定值（17.3 mM-1cm-1），因?yàn)槠毡檎J(rèn)為PNP的摩爾吸光系數(shù)不隨反應(yīng)介質(zhì)及其濃度和pH值而改變[14]。本文還首次系統(tǒng)地研究了緩沖液的種類、濃度和pH對反應(yīng)產(chǎn)物PNP的摩爾吸光系數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)不同種類、不同濃度和不同pH的緩沖液中產(chǎn)物PNP的摩爾吸光系數(shù)不同。因此，測定堿性磷酸酶的酶活性時要根據(jù)不同的反應(yīng)條件選擇產(chǎn)物PNP不同的摩爾吸光系數(shù)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在研究的5種緩沖液中，DEA緩沖液是激活型緩沖液，不僅能給堿性磷酸酶催化反應(yīng)提供緩沖作用，還可以作為磷酸?；氖荏w，提高催化反應(yīng)的速度[15]。在堿性磷酸酶的應(yīng)用中，參考這些最適條件，應(yīng)用效率會得到很大的提高。NaN3是一種防腐劑，可以抑制微生物的生長，是堿性磷酸酶保存液的必備成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，NaN3對堿性磷酸酶的動力學(xué)性質(zhì)沒有影響。聚乙二醇對酶具有一定的穩(wěn)定化作用。

以上的酶學(xué)性質(zhì)的研究對兩種心肌標(biāo)志物的ELISA檢測體系的建立起到一定的幫助作用。cTnI和CRP免疫檢測體系的建立，達(dá)到很好的檢測靈敏度和精確度，這對開發(fā)心肌標(biāo)志物的ELISA檢測試劑盒有很好的應(yīng)用價值。