李露怡，嚴躍文，李娟，鄧長柏

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 兒科，廣東 廣州 510700；2.中能建電力醫(yī)院 兒科，廣東 廣州 510500）

手足口病（hand-food-and-mouth disease,HFMD）是兒科常見的傳染病，多見于5歲以下小兒，表現(xiàn)為手足臀部皰疹、口腔潰瘍和發(fā)熱等，可由多種病毒感染所致，大部分為普 通型病例，少數(shù)為EV71型病毒感染所致重型病例，合并神經源性肺水腫、腦炎和心肌炎等，死亡率高，近年有爆發(fā)流行的報道。HFMD發(fā)病機制不清，本文通過檢測患兒外周血細胞因子及其信號轉導和轉錄激活因子3（signal transduction and activation of transcription 3,STAT3）和磷酸化的STAT3（P-STAT3）蛋白，探討其發(fā)病機制，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

59例HFMD患兒，均是門診初次就診患者，男33例，女26例；年齡1～8歲，按照衛(wèi)生部制定手足口?。?010年版）診斷標準入選，均為普通型病例。此外，在兒童保健科門診體檢收集30例健康小兒（同年齡、性別，具有可比性）外周血標本，作為對照組，分別檢測其細胞因子和外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中STAT3、P-STAT3蛋白表達。

1.2 實驗方法

1.2.1 相關試劑、儀器及來源 PBS沖洗液、細胞裂解液［1 M Tris-CI（pH 7.4）5 ml，0.5 M EDTA 2 ml，NaCl 0.876 g、NaN30.02 g，Triton-x 100 ml，加ddH2O至100 ml即可用］均購于武漢晶賽生物工程公司；白介素-6、10、17等單克隆抗體試劑盒全部購于美國eBioscience公司。抗STAT3和P-STAT3抗體（第一、二抗體分別是兔抗人和羊抗兔抗體）和Western blot試劑盒、ECL（化學發(fā)光增強試劑盒）全部購于eBioscience公司，美國真空轉膜印跡系統(tǒng)、BioRad-Jeldoc2000圖像分析系統(tǒng)等儀器。

1.2.2 標本上清液和外周血PBMC制備 抽取患兒靜脈血5 ml，加入肝素抗凝管中，加入紅細胞裂解液，離心分離（每分鐘3 000轉）10 min，取上清液儲存凍存于-80℃冰箱中用于細胞因子檢測；下部分用PBS緩沖液沖洗，制備PBMC。

1.2.3 PBMC中STAT3和P-STAT3蛋白提取 在PBMC中加入細胞裂解液100 μl，超聲粉碎，12 000 rpm、4℃離心20 min，取上清液測濃度，-20℃～-70℃凍存。

1.2.4 ELISA實驗方法檢測和質量控制 檢測細胞因子（IL-6、IL-10、IL-17）：酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）具體操作步驟按試劑盒說明進行，即取用存儲的血標本，加入一抗和生物素標記的二抗、溫育、洗涕和顯色，比色結果。為得到準確的結果，進行質量控制。首先保證各批標本合格，如標本存儲時間少于6 個月，實驗操作準確，再次進行預實驗檢測，取得質控血清和曲線圖，并采用即刻質控統(tǒng)計學方法：如在相同實驗條件下，多次（20次以上）檢測，結果取均值加減2個標準差（x±2 s）為可靠值，大于95%值或小于5%值去掉。

1.2.5 Western blot檢測STAT3和P-STAT3蛋白表達 取上述凍存的蛋白提取液50 μg，加等體積樣品緩沖液經變性后點樣、電泳及顯影等步驟檢測（見分子生物學操作手冊和試劑盒說明進行），用β-actin做對照帶，檢測其對比光密度，先制定A590值標準曲線，再取100 μl，測量A590值，根據(jù)標準曲線得出樣本蛋白質含量?？筎AT3和P-STAT3抗體（第一、二抗體分別是兔抗人和羊抗兔抗體）和Western blot試劑盒全部購于eBioscience公司。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3結 果

59例HFMD患兒急性期血中白介素均升高，與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見表1。

2.2 HFMD患者外周血單核細胞中STAT3和P-STAT3（Western blot）

59例HFMD患兒P-STAT3蛋白表達明顯增強，較對照組明顯升高，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見表1。具體表達圖（Western blot）見圖1和圖2。

表1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3結果 （）

表1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3結果 （）

組別 例數(shù) IL-6/(pg/L) IL-10/(pg/L) IL-17/(pg/L) STAT3 P-STAT3 HFMD 59 40±6.2 54±8.5 33±4.4 126.60±2.67 72.31±2.46對照組 30 17±5.5 23±3.4 19±4.2 125.90±3.70 0.00±0.000 t值 17.577 19.260 14.274 0.92 225.00 P值 0.001 0.001 0.001 0.324 0.001

圖1 STAT3和P-STAT3蛋白表達（Western）

圖2 STAT3和P-STAT3蛋白表達（Western blot）

3 討論

手足口病是小兒常見的急性傳染病，好發(fā)于4～7月份和10～11月份，與氣溫變化有關[1-2]；近年來有爆發(fā)流行的報告，部分病例可出現(xiàn)并發(fā)癥如腦炎、肺水腫等[3]。自從1957年加拿大首次報告以來，該病一直在全世界發(fā)生；研究表明，多種腸道病毒如科薩奇病毒、EV71病毒等均可導致HFMD[4]，雖然經過幾十年的研究，但其發(fā)病機制尚未完全清楚，值得進一步研究。

細胞信號轉導與轉錄激活因子（STAT）是細胞因子在細胞內重要的信息傳遞分子（蛋白家族），其激活（磷酸化）后使細胞核基因激活和表達，產生效應[5]。研究表明STAT3是IL-6在細胞內的重要的信息傳遞分子，在感染、腫瘤、缺氧損害和免疫等疾病發(fā)揮重要的作用[6-9]。

手足口病臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、手足部出現(xiàn)皰疹，其本質是炎癥反應的結果。在筆者的前期研究中發(fā)現(xiàn)，手足口病患者血中前炎癥介質（白介素-6、白介素-10、白介素-17、白介素-21）和Th17淋巴細胞等明顯升高，促進疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。目前在國內尚未見有HFMD患者白介素-6信號轉導及轉錄因子3（STAT3）變化的報道；據(jù)此本文進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)在HFMD組患者IL-6信號通路激活，即磷酸化的STAT3表達增加（72.31±2.46），而總的STAT3沒有增加（HFMD組和健康對照組分別是（126.60±2.67）和（125.90±3.70），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），磷酸化的STAT3在HFMD組中升高，和健康小兒組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），說明細胞因子信號通路激活在HFMD發(fā)生中起重要的作用，病毒感染和STAT3變化的關系值得進一步研究。國內王艷等[11]在實驗研究中發(fā)現(xiàn)：EV71病毒感染橫紋肌肉瘤細胞，下調STAT3和P-STAT3，STAT3可影響多種病毒的復制；Hill等[12]報道，STAT3具有抑制EB病毒對B淋巴細胞溶解的作用；Read等[13]研究報道，病毒感染通過MAPK.NFKB和STAT3信號通路促進細胞癌變和發(fā)展；而丙型肝炎病毒感染通過STAT3途徑導致肝臟損害[14]。因此，STAT3在病毒感染所致的疾病發(fā)生發(fā)展中起到雙刃劍的作用。本研究證實手足口病的發(fā)生發(fā)展也通過STAT3途徑，其信號通路激活可能促進外周血有核細胞分泌更多的細胞因子，促進HFMD的發(fā)生，STAT3有可能成為治療靶標，具有一定的臨床意義。 因此，STAT3與HFMD的關系值得進一步研究。