邢宇鋒 翟芬芬 韓志毅 彭得倜 鐘偉超 周大橋 童光東

1.深圳市中醫(yī)院肝病科 (廣東 深圳， 518033) 2.深圳市福田區(qū)慢性病防治院

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是無過量飲酒史，而出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性、彌散性肝小葉輕度炎癥和/或有肝竇周圍、肝中央靜脈膠原沉積等病理特征的慢性肝臟炎性疾病[1, 2]。NASH作為單純性脂肪肝發(fā)展成為肝纖維化的一段病理階段，是非酒精性脂肪性肝病( NAFLD) 常見的病理類型[3]。NASH的持久存在已成為肝硬化及肝癌的重要因素之一[4]。

目前該病在治療上仍以運(yùn)動(dòng)、控制體重為主，他汀類降脂藥能夠改善血脂和膽固醇水平，但該類藥物具有一定的副作用，其臨床應(yīng)用有一定受限。我們前期臨床研究發(fā)現(xiàn)疏肝消脂方可以顯著改善NASH患者肝臟炎癥，降低血脂及體重[5, 6]。本研究采用疏肝消脂方干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠，以進(jìn)一步明確疏肝消脂方防治NASH的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠90只(2月齡)，雌雄各半，體重180g～220g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證：SYXK(粵)2013-0001]，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 藥物與試劑 疏肝消脂方組成: 柴胡、枳實(shí)、桅子各10g，炒白芍15 g，茵陳、澤瀉、山楂、海浮石各30g等。本研究采用免煎顆粒劑，購自深圳華潤三九有限公司。非諾貝特膠囊(力平之，法國利博福尼公司，批號(hào)：H20140369) 。甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒均購于上海科華生物工程股份有限公司；Trizol購于TAKARA公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑均購于德國DBI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 分光光度計(jì)，(UV-1206，日本SHIMODZU公司)；冷凍離心機(jī)(SCR20B，日本HITACHI公司)；電子天平(BS210S，日本Satorius公司)；(PCR擴(kuò)增儀美國ABI公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(StrataGene Mx3000P ，美國Agilent公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 按體重分層隨機(jī)法，分為6組：正常組、高脂模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組、非諾貝特對(duì)照組。

1.4.2 動(dòng)物造模及給藥 采用經(jīng)典的高脂飼料誘導(dǎo)大鼠肝臟組織脂肪變性的方法，復(fù)制 NASH 大鼠模型[7]。正常組大鼠給予普通飼料，其他 5 組大鼠則投喂高脂飼料(普通飼料加1%膽固醇、10% 蛋黃粉和10% 豬油)，連續(xù)喂養(yǎng) 12 周。造模第8周，每組隨機(jī)抽選5只，做肝組織病理檢測以判斷造模是否成功。予各組大鼠給予相應(yīng)藥物灌胃：非諾貝特組( 0.1 g/kg/d)、疏肝消脂方低、中、高劑量組(70 kg 成人等效劑量 1、2、4 倍，10 g/kg/d、20 g·kg/d、40 g·kg/d)。正常組、高脂模型組則給予等體積蒸餾水灌胃。采集標(biāo)本前 1 d 各組禁食不禁水，次日上午以10% 水合氯醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清置于-80℃冰箱保存待用；在肝右葉距邊緣1cm處取肝組織兩份，一份以4%多聚甲醛固定，一份于-80℃冰箱保存待用。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 各組大鼠肝臟組織濕重 分析天平稱量各組大鼠肝臟組織濕重,結(jié)合末次大鼠體重,計(jì)算肝指數(shù)：肝指數(shù)=肝濕重/體重×100%。

1.5.2 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)檢測 將4% 多聚甲醛固定的肝組織取出，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，常規(guī)制備石蠟切片，烘干。蘇木素-伊紅(HE)染色后，光鏡下觀察大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.5.3 各組大鼠肝臟脂質(zhì)檢測 取適量新鮮大鼠肝組織, 制組織勻漿, 并用甲醇-氯仿(按照1∶1)抽提液抽提脂質(zhì)，以分光光度法測定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG) 的含量。

1.5.4 各組大鼠肝組織PPARα和SREBP-1c基因表達(dá)檢測 采用 RT-PCR法檢測各組大鼠肝組織中PPARα和SREBP-1c基因表達(dá)情況。方法如下：每組隨機(jī)抽取5只大鼠，在肝右葉距邊緣1cm處取肝組織作為樣本，抽取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA作為模板，按照試劑盒說明分別加入引物和 Bestar·SybrGreen qPCR master Mix等，PCR反應(yīng)條件：94℃ 2min，94℃ 20s，58℃ 20 s，72℃ 20s，40循環(huán)。融解曲線分析：溫度62℃～95℃。每個(gè)樣品重復(fù)3次熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

表1 引物序列熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，P<0.01或P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理HE 染色結(jié)果 空白組大鼠肝組織著色均勻，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，未見脂肪病變性；高脂模型組大鼠肝小葉內(nèi)可見脂肪空泡、肝細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變，肝細(xì)胞內(nèi)見大量脂肪空泡，小葉內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤。疏肝消脂方低劑量組大鼠可見輕度的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)有散在空泡現(xiàn)象，比模型組有所改善。疏肝消脂方中、高劑量組和非諾貝特對(duì)照組，可見到肝組織脂肪變性、肝細(xì)胞腫脹的程度較模型組均明顯改善，肝細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)增多，趨于正常細(xì)胞。

2.2 各組大鼠肝脂質(zhì)水平和肝指數(shù)情況 見表2。與正常組比較，高脂模型組大鼠肝臟中TG、TC均顯著升高(P<0.01)。與高脂模型組比較，非諾貝特對(duì)照組、疏肝消脂方高、中劑量組大鼠肝臟中TG、TC水平能顯著降低(P<0.05或P<0.01))，疏肝消脂方低劑量組大鼠肝臟中TC水平顯著降低(P<0.05)；非諾貝特、疏肝消脂方各劑量組大鼠肝指數(shù)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組大鼠肝脂質(zhì)水平和肝指數(shù)比較 (x±s)

與正常組比較，▲▲P< 0.01; 與高脂模型組比較，*P<0.05，**P< 0.01

2.3 各組大鼠肝組織PPARα和SREBP-1c基因表達(dá)情況 見表3。與正常組比較，高脂模型組中大鼠肝組織的PPARα基因表達(dá)顯著降低(P<0.05)，SREBP-1c基因顯著升高(P<0.01)；與高脂模型組比較，疏肝消脂方各劑量組大鼠肝組織PPARα基因的表達(dá)，明顯增強(qiáng)肝組織SREBP-1c基因的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。

表3 各組大鼠肝組織PPARα和SREBP-1c基因表達(dá)比較 (x±s)

與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01; 與高脂模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

NASH是以肝細(xì)胞脂肪變性、灶性壞死及小葉內(nèi)炎癥為特征的遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性肝病。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，當(dāng)前Day等人根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出的二次打擊假說[8]，仍在NASH發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。

高脂或高熱量飲食、脂肪組織釋放、肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成增多等，產(chǎn)生過量的游離脂肪酸(FFA)，引發(fā)肝細(xì)胞內(nèi)脂類的聚集[9]。肝細(xì)胞內(nèi)的脂類不斷聚集(第一次打擊)可導(dǎo)致了一系列的肝細(xì)胞毒素事件( 第二次打擊) ，產(chǎn)生肝臟的炎性反應(yīng)[10]。肝臟的FFA增多時(shí)，引起TC、TG的合成超過其輸出，導(dǎo)致TC、TG 在肝內(nèi)蓄積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，高脂模型組大鼠肝組織TC、TG含量較正常組顯著升高。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c (SREBP-1c)與NASH的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在NASH脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[11]。肝臟的PPARα可影響脂蛋白和長鏈脂肪酸代謝，調(diào)控脂質(zhì)代謝。PPARα的表達(dá)受抑時(shí)，與肝內(nèi)脂肪酸代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)、酶基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，減少脂肪酸的氧化和加重肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積及炎癥反應(yīng)[12]。SREBP-1c是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)脂肪酸和甘油三酯的重要調(diào)控因子，可激活下游多種參與脂肪酸和甘油三酯合成酶的轉(zhuǎn)錄，使脂肪酸合成增加，進(jìn)而造成肝臟脂質(zhì)的蓄積[13]，因此以從脂質(zhì)代謝信號(hào)通路相關(guān)基因入手，開展對(duì)NASH脂質(zhì)代謝紊亂機(jī)制研究具有重要意義。

前期研究已證明，疏肝消脂方對(duì)NAFLD患者的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)具有明顯的改善作用。采用疏肝消脂方干預(yù)NASH大鼠，發(fā)現(xiàn)疏肝消脂方組大鼠血液中TG、TC、FFA、全血黏度(低切)、血漿黏度值、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和AST的水平明顯下降(P<0.01)[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，疏肝消脂方各劑量組大鼠肝組織TG、TC及肝指數(shù)均較高脂模型組出現(xiàn)不同程度的降低，提示疏肝消脂方能有效地改善 NASH 大鼠肝臟脂肪沉積，有效的阻止了NASH的進(jìn)展。這與本課題組前期臨床的研究結(jié)果基本一致的[5]。同時(shí)，疏肝消脂方高中低劑量即可明顯增強(qiáng)大鼠肝組織PPARα基因的表達(dá)，降低肝組織SREBP-1c基因的表達(dá)。這表明，疏肝消脂方可能通過上調(diào)PPARα、下調(diào)SREBP-1c基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)肝內(nèi)脂肪酸代謝，促進(jìn)脂肪酸β氧化，這可能是其治療NASH 的作用機(jī)制之一。疏肝消脂方防治NASH也可能是多途徑、多層次、多靶點(diǎn)調(diào)控的結(jié)果，其詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究和分析。