劉燕燕，祁文瑾

女性陰道微生態(tài)體系由陰道內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)、微生態(tài)菌群，局部?jī)?nèi)分泌調(diào)節(jié)功能和免疫功能組成[1]。這是一個(gè)非常靈敏的系統(tǒng),在受到內(nèi)源性和外源性因素影響時(shí),容易發(fā)生改變[2-3]，而導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，如細(xì)菌性陰道病、外陰陰道假絲酵母菌病和滴蟲陰道炎等，由于直接進(jìn)行患者陰道局部組織取材研究相對(duì)困難，利用體外培養(yǎng)的陰道上皮細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究可能更具可行性。該研究旨在探索一種簡(jiǎn)單有效的正常小鼠陰道上皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑Epilife Medium、0.06 mol/L氯化鈣溶液、HKGS Kit(含胰島素生長(zhǎng)因子-1 5 μg/ml，氫化可的松0.18 mg/ml，牛轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5 mg/ml，慶大霉素/兩性霉素B 1 ml，表皮生長(zhǎng)因子200 ng/ml，牛腦垂體提取物24 mg/ml)、DMEM/F12、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.25%胰酶+0.02%EDTA(美國(guó)Gibco公司)；中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ，美國(guó)Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó)Solarbio公司)；100 U/ml青、鏈霉素(美國(guó)Solarbio公司)；兔抗鼠廣譜角蛋白抗體 (Rabbit Anti-P-CK,北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞角蛋白5/6抗體 (CK5/6，上海江萊生物科技有限公司)；10×多聚賴氨酸 (美國(guó)Solarbio公司)。

1.2器材LD5-2A高速離心機(jī)(北京雷勃爾公司)，3111型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司), CK40-F200倒置顯微鏡(日本OLYMPUS), BHC-1300IIA/B超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明雌鼠，6～8周，22～28 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(滇)K2015-0002。

1.4陰道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)小鼠稱重記錄后，斷頸處死，頭部向下浸于75%酒精中消毒20 s，防止酒精浸入陰道。在超凈臺(tái)內(nèi)充分暴露小鼠腹部，沿著雙角子宮下端找到陰道，充分剝離周圍結(jié)締組織，無菌操作下分別從宮頸口和陰道口處向上5 mm處取1 cm×0.5 cm大小的陰道組織6塊，置于6孔板內(nèi)，分別用4 ℃含雙抗的PBS徹底清洗，直至PBS不再渾濁后，將陰道組織轉(zhuǎn)移至新的6孔板內(nèi)，與2 U/ml的DispaseⅡ 1 ∶2混合，置于4 ℃冰箱過夜。第2天，用眼科鑷分離陰道上皮層和固有層，棄固有層，將上皮層組織與0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1 ∶2的體積比混合，放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 min后，用無菌槍頭輕輕吹打上皮層30 s后，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育10 min，再次輕輕吹打上皮層直至在光鏡下沒有成團(tuán)的細(xì)胞，加入與0.25%胰酶-0.02%EDTA同體積的含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，將所得的細(xì)胞懸液通過200目尼龍膜過濾，濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入沉淀細(xì)胞團(tuán)體積10倍的PBS 重懸細(xì)胞，離心棄上清液，加入Epilife重懸，使細(xì)胞密度達(dá)到1×105～1×106個(gè)/ml，移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后首次換液，以后每2 d換液1次。

1.5傳代培養(yǎng)到第7～9天，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，進(jìn)行第1次傳代，棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，加適量的PBS輕輕吹打瓶底，棄上清液，重復(fù)2次，加入0.25%胰酶1 ml浸泡細(xì)胞表面，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，光鏡下觀察，細(xì)胞間隙增大，大部分細(xì)胞呈圓球形，加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，用無菌槍頭輕輕吹打瓶底細(xì)胞，將細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入沉淀細(xì)胞團(tuán)體積10倍的PBS重懸細(xì)胞，再次離心后，棄上清液，加入與第一次離心時(shí)PBS等體積的Epilife重懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加2 ml Epilife重懸，以1 ∶2比例轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6陰道上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

1.6.1光鏡下觀察陰道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特征并進(jìn)行HE染色 取原代生長(zhǎng)匯合度將近80%～90%的上皮細(xì)胞，胰酶消化后，在預(yù)先用多聚賴氨酸處理過的玻片上，制作成細(xì)胞爬片, PBS液漂洗，用95%乙醇固定，待干后，蘇木精染色5 min，流水洗1 min，75%鹽酸乙醇分化10 s，流水洗1 min，伊紅染色1 min，酒精梯度脫水，透明后,中性樹脂封固,鏡檢。

1.6.2掃描電鏡觀察 原代生長(zhǎng)匯合度將近80%～90%的上皮細(xì)胞，胰酶消化后，在預(yù)先用多聚賴氨酸處理過的24孔蓋玻片上制作細(xì)胞爬片, 用PBS液漂洗蓋玻片， 2.5%戊二醛4 ℃固定1 h。PBS液清洗,1%鋨酸固定、脫水,真空鍍膜儀上干燥后噴金,掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表面情況。

1.6.3免疫組織化學(xué)染色 取原代生長(zhǎng)匯合度將近80%～90%的上皮細(xì)胞，胰酶消化后，在預(yù)先用多聚賴氨酸處理過的玻片上，制作細(xì)胞爬片，PBS液漂洗，用95%乙醇固定，分別用P-CK、CK5/6抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,用0.01% PBS漂洗,再以含生物素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng),DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水、透明后,中性樹脂封固,鏡檢。

2 結(jié)果

2.1陰道上皮原代細(xì)胞生長(zhǎng)特性觀察和HE染色酶消化的原代陰道上皮細(xì)胞24 h后大部分貼壁并逐漸伸展，培養(yǎng)7～9 d,匯合度達(dá)80%～90%，具有上皮細(xì)胞特性：呈多角形,輪廓清晰,折光性強(qiáng),呈鋪路石樣生長(zhǎng)。見圖1。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快,4～6 d即可融合。HE染色后，胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞形態(tài)成多角形，呈鋪石樣生長(zhǎng)。見圖2。

圖1 光鏡下不同培養(yǎng)天數(shù)原代陰道上皮細(xì)胞貼壁情況 ×10

圖2 HE染色的第4天原代細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.2電鏡觀察掃描電鏡下上皮細(xì)胞呈鑲嵌排列,細(xì)胞間界限清楚,表面布滿質(zhì)膜皺褶微絨毛,呈不規(guī)則疏網(wǎng)狀,稱為微絨毛嵴。細(xì)胞邊緣因?qū)佣龊?微絨毛嵴則變密變短,形成清楚的分界線。細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,見圖3。

圖3 掃描電鏡下不同培養(yǎng)天數(shù)原代陰道上皮細(xì)胞形態(tài)

A：原代第2天 ×2 000；B: 原代第4天 ×1 000;C：原代第6天 ×1 000; D：原代第8天 ×300

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色經(jīng)P-CK染色的細(xì)胞，胞質(zhì)呈棕黃色，均為廣譜角蛋白陽性細(xì)胞，見圖4。表明所有細(xì)胞均為上皮細(xì)胞，少有成纖維細(xì)胞污染。經(jīng)CK5/6染色的細(xì)胞，胞質(zhì)成棕黃色，均為CK5/6陽性細(xì)胞，見圖5。進(jìn)一步表明所有細(xì)胞均為鱗狀上皮細(xì)胞。

圖4 P-CK染色的細(xì)胞

A:光鏡下原代細(xì)胞第4天 ×40 ;B:光鏡下原代細(xì)胞第4天 ×20

圖5 CK5/6染色的細(xì)胞

A：光鏡下原代細(xì)胞第4天 ×40； B：光鏡下原代細(xì)胞第4天 ×20

3 討論

小鼠陰道黏膜由復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞所覆蓋，受卵巢雌、孕激素的影響而有周期性變化；雌激素使上皮細(xì)胞增生、角化，孕激素使陰道上皮細(xì)胞脫落加快。陰道黏膜的基底層細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力,因此暴露并分離出基底層細(xì)胞是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。該研究采用的DispaseⅡ是一種中性蛋白酶,可選擇性地分解基底膜Ⅳ型膠原和纖維黏連蛋白,不破壞上皮間的細(xì)胞連接,與胰酶相比,可以完整的分離陰道上皮層,更好地保留基底細(xì)胞層,從而獲取更多的增殖細(xì)胞[4]。用DispaseⅡ和胰酶分步消化后,陰道上皮細(xì)胞24 h后開始貼壁,3～5 d增殖迅速,7～9 d可融合至80%～90%，大大縮短了原代培養(yǎng)的周期。

陰道上皮體外繁殖能力低,對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求較高,目前報(bào)道過的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基有1640[5]、DMEM+F12[6]、K-SFM[7-10]、DK-SFM[11-12]和Epilife[13]。前兩種培養(yǎng)基中都加入了胎牛血清，由于血清促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的作用，使細(xì)胞易于老化，減少細(xì)胞傳代次數(shù)，使成纖維細(xì)胞優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，不利于上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。且需要經(jīng)過傳代1～2次，才能獲得純化高的陰道黏膜干細(xì)胞，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)成本大。不少國(guó)內(nèi)外報(bào)道[7-9]用K-SFM培養(yǎng)陰道上皮、口腔上皮、牛汗腺等上皮細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中選用了K-SFM培養(yǎng)基，但近期因國(guó)內(nèi)禁止進(jìn)口導(dǎo)致貨源不穩(wěn)定而停用，而選用DK-SFM培養(yǎng)，細(xì)胞增殖不是很理想，很有可能與該培養(yǎng)基supplement成分中的BPE是人工合成，缺少生物活性有關(guān)。Sch?n et al[13]在培養(yǎng)人宮頸上皮細(xì)胞選用Eplife，加用HKGS和0.4 mmol /L氯化鈣， Hammiller et al[14]建議在培養(yǎng)小鼠上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基的氯化鈣濃度為0.02～0.09 mmol /L，故該實(shí)驗(yàn)取用Eplife加用HKGS和0.02 mmol /L氯化鈣獲得了純度高、可傳3～4代的陰道上皮細(xì)胞。

該實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的陰道上皮細(xì)胞光鏡下呈多角形,大小均一,融合成片后緊密排列如鋪路石樣,通過掃描電鏡從二維視覺動(dòng)態(tài)觀察陰道上皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，由水滴狀慢慢延展為多角形，達(dá)到接觸抑制。細(xì)胞表面可見許多微絨毛和脊樣胞質(zhì)皺褶,符合典型的上皮細(xì)胞特點(diǎn)。從而提示在酶消化后靜置培養(yǎng)箱培養(yǎng)的重要性，讓有活力的陰道上皮細(xì)胞充分貼壁生長(zhǎng)，在培養(yǎng)初期換液需輕柔，而非為了減少成纖維細(xì)胞成長(zhǎng)過早、過頻地吹壁、換液。P-CK和CK5/6免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性,進(jìn)一步證實(shí)為鱗狀上皮細(xì)胞。

該實(shí)驗(yàn)在對(duì)培養(yǎng)基的改良后培養(yǎng)出純度較高、可傳3～4代的陰道上皮細(xì)胞，為后期進(jìn)行女性生殖道微生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)而導(dǎo)致相關(guān)陰道感染疾病的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。