楊媛媛，何文竹，袁 靜，李 莉，尹宗智

無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)是利用二代測序技術(next generation sequencing, NGS)對母體血漿中游離胎兒DNA進行高通量測序，可準確、安全地對胎兒染色體非整倍異常疾病進行篩查[1-4]。Ion torrent半導體測序技術是在二代454測序技術基礎上，在信號檢測環(huán)節(jié)摒棄了焦磷酸偶聯(lián)反應檢測，而采用先進的半導體H離子檢測技術，使其在保持了454的諸多優(yōu)點(如波長長、應用范圍廣泛等)基礎上，具有高通量、檢測簡單迅速、成本低的優(yōu)勢[5-6]，該項技術的臨床應用價值仍需驗證和評估。該研究利用Ion Torrent半導體測序平臺檢測孕婦外周血漿中的游離DNA，行胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測，以研究無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術的敏感性、特異性， 從而探討無創(chuàng)DNA檢測技術在產(chǎn)前診斷中的臨床實際應用價值。

1 材料與方法

1.1病例資料選擇2015年1月～2017年3月在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院接受遺傳咨詢并知情同意下行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測患者。

入組標準：① 血清學篩查、影像學檢查顯示為常見染色體非整倍體臨界風險(即 1/1 000≤唐氏綜合征風險值<1/270，1/1 000≤18-三體綜合征風險值<1/350)的孕婦；② 有介入性產(chǎn)前診斷禁忌證者(先兆流產(chǎn)、發(fā)熱、有出血傾向、感染未愈等)；③ 就診時，患者為孕 20+6周以上，錯過血清學篩查最佳時間，或錯過常規(guī)產(chǎn)前診斷時機；④ 高齡孕婦(年齡35歲)或常規(guī)血清學檢查高風險孕婦，在接受遺傳咨詢下要求無創(chuàng)產(chǎn)前檢測 。

排除標準：① 多胞胎孕婦；② 既往妊娠胎兒有染色體異常；③ 夫妻雙方有染色體疾病攜帶、遺傳基因病家族史；④ 孕婦接受過異體輸血、移植手術或干細胞治療，或腫瘤患者等。

1.2無創(chuàng)DNA檢測方法抽取孕婦外周血5 ml置于 EDTA 抗凝管內(nèi)，4 ℃保存，在4 h 內(nèi)分離血漿提取胎兒游離DNA，利用Ion Torrent 半導體測序平臺測序，通過生物信息分析得出胎兒患21-、18-、13-三體綜合征的風險率，檢測結(jié)果介于-3.0～+3.0為低風險，對其胎兒出生后情況進行電話隨訪；不在此范圍內(nèi)的為高風險，孕婦需接受有創(chuàng)產(chǎn)前診斷進行確診。

1.3胎兒染色體核型分析對檢測結(jié)果高風險孕婦，簽署知情同意后采集羊水或者臍血，進行G顯帶染色體核型分析。

1.4隨訪對所有納入研究的孕婦所生胎兒進行出生后隨訪。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，計數(shù)資料采用率表示。

2 結(jié)果

2.1無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果本研究共納入孕婦6 064例，其中唐篩臨界風險2 196例(36%)，唐篩高風險且有創(chuàng)禁忌1 453例(24%)，錯過唐篩機會818例(14%)，影像學檢查異常123例(2%)，高齡孕婦1 415例(23%)，其他因素患者59例(1%)。所有行NIPT檢測患者中，檢測結(jié)果異常者49例，其中21-三體綜合征27例,18-三體綜合征18例,13-三體綜合征4例。21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征的陽性率分別為4.45‰、2.97‰、0.66‰。

2.2胎兒染色體核型分析及隨訪結(jié)果通過對49例NIPT檢測提示異常的孕婦進行胎兒染色體核型分析，結(jié)果顯示：27例NIPT檢測提示21-三體綜合征陽性者中有23例胎兒染色體核型分析為21-三體綜合征陽性，1例為陰性，3例失訪(2例死胎，1例因失聯(lián)失訪)；18例NIPT檢測提示18-三體綜合征陽性者中有16例胎兒染色體核型分析為18-三體綜合征陽性，1例為陰性，1例死胎失訪；4例NIPT檢測提示13-三體綜合征陽性者中有3例胎兒染色體核型分析為13-三體綜合征陽性，陰性者0例，1例因死胎失訪。通過隨訪發(fā)現(xiàn)，NIPT檢測提示無異常的6015例孕婦中，有1例嬰兒經(jīng)確診為21-三體綜合征患兒。通過上述數(shù)據(jù)可以得出NIPT檢測的靈敏度和特異度，見表1。

表1 NIPT檢測的靈敏度和特異度(%)

3 討論

臨床上常見的染色體異常疾病包括21-三體綜合征、18-三體綜合征及13-三體綜合征。此類患兒出生后，主要表現(xiàn)為智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等，給家庭和社會帶來沉重負擔，目前尚無治愈方法。 完善產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方法，最大限度避免此類疾病患兒出生，是目前我國最迫切需要解決的問題。

診斷胎兒染色體疾病，國內(nèi)常用的產(chǎn)前篩查方法為妊娠中期的血清學三聯(lián)篩查，其準確率僅為65%，假陽性率高達8%[7]。國內(nèi)外常用的侵入性產(chǎn)前診斷方法為絨毛、羊膜腔穿刺、臍靜脈穿刺行染色體核型分析。侵入性產(chǎn)前診斷技術被認為是產(chǎn)前診斷的“金標準”，但其操作復雜，技術要求高，實驗周期較長，且行有創(chuàng)操作的孕婦流產(chǎn)、感染等損傷風險增高[8]。

Lo et al[9]在1997年首次證實孕婦外周血液循環(huán)中有胎兒游離DNA(cell-free DNA, cf-DNA)存在。研究顯示：妊娠4周開始孕婦的外周血中就能檢測出胎兒游離DNA，以后隨著孕周的增加cf-DNA濃度緩慢增加，cf-DNA 的特點既顯示其應用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的可行性，也表明NITP 檢測對孕周和年齡的覆蓋范圍非常廣泛。Chiu et al[10]在2008年首次用大規(guī)模平行測序(massively parallel sequencing，MPS)技術平臺檢測胎兒非整倍體，使cff-DNA大規(guī)模用于臨床產(chǎn)前診斷。Lo et al[11]在2010年通過進一步研究表明，對孕婦外周血中的胎兒游離DNA進行全基因測序是診斷胎兒染色體疾病的一種可靠的非侵入性診斷方法。

NIPT通過對孕婦外周血中胎兒游離DNA進行直接分析，流程簡便，避免了有創(chuàng)操作導致的流產(chǎn)、感染等風險，易被患者接受。本研究通過對我院2年多的研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，利用Ion torrent半導體測序檢測技術檢測21-三體綜合征靈敏度為96.3%，特異度為為95.0%；18-三體綜合征檢測靈敏度為100.0%，特異度為93.3%；13-三體綜合征檢測靈敏度為100.0%，特異度為100.0%，對3種最常見胎兒非整倍體疾病的檢測靈敏度及特異度均較高。

由于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測原理是基于統(tǒng)計學方法進行風險評估而非直接量化計算，因此必然會存在一定概率的假陽性和假陰性病例，本研究中發(fā)現(xiàn)有2例假陽性(21-三體綜合征及18-三體綜合征各1例)和1例假陰性。限制性胎盤嵌合體、孕婦本人嵌合體、雙胎之一胎死宮內(nèi)或胚胎停育，或者孕婦本人患惡性腫瘤疾病、前期接受過異體輸血、器官移植、干細胞治療等均可影響NIPT陽性結(jié)果與染色體核型的一致[12-14]。因此，針對NIPT檢測陽性者，仍需建議患者進一步行胎兒染色體核型分析來確診，同時產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷是體系化的醫(yī)療行為，應做好全面完善的檢測前咨詢、檢測后咨詢、高危人群的產(chǎn)前診斷及篩查人群的隨訪。

Ion torrent半導體測序技術相較于傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查及診斷技術具有高準確性、無創(chuàng)傷性、檢測周期短、適用孕周及年齡范圍大等優(yōu)點。該方法目前已在臨床逐漸廣泛推廣，由于其檢測費用仍偏高，不能用于替代大規(guī)模人群篩查；而其診斷的靈敏度限制了NIPT目前仍不能替代傳統(tǒng)的有創(chuàng)操作下胎兒染色體核型分析技術。

目前文獻報道無創(chuàng)DNA檢測技術僅限于21-、18-、13-三體綜合征的檢測，我院目前引入無創(chuàng)DNA升級檢測技術無創(chuàng)DNA-Plus，檢測范圍由三大染色體疾病升級為14種，包括常見的微重復、微缺失疾病，相關數(shù)據(jù)在進一步收集及分析中，有望推進無創(chuàng)DNA檢測技術更好地服務于臨床工作。