楊旭東，陳 炯，趙金錢，胡丕波

消化道腫瘤中，胰腺癌屬于惡性等級(jí)非常高的一類，死亡率一直居高不下，5年生存率不及5%[1]。在美國(guó)，該疾病在造成癌癥死亡原因中位列第三，遠(yuǎn)高于乳腺癌[2]。目前認(rèn)為胰腺癌患者長(zhǎng)期生存唯一有效的方法是手術(shù)切除，15%～20%的病例是可能根治性切除的，但這些患者的5年生存率低于10%[3]。由于其發(fā)病隱匿，病情發(fā)展迅速，一經(jīng)確診大多處于晚期或發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，往往喪失了最佳手術(shù)機(jī)會(huì)，因此治療效果及預(yù)后極差。人類組織激肽釋放酶(human tissue kallikreins，KLK)基因家族由15個(gè)成員(KLK1-KLK15)組成，是整個(gè)人類基因組中最大的連續(xù)的肽酶編碼基因簇。KLK11位于染色體區(qū)域位點(diǎn)19q13.3-q13.4(16，25)。該研究通過(guò)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)法檢測(cè)KLK11在胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織中表達(dá)，并將KLK11的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平作為切入點(diǎn)，探究其在胰腺癌中的表達(dá)情況，再針對(duì)其和該疾病患者臨床病理資料之間的關(guān)聯(lián)性展開(kāi)剖析，進(jìn)一步分析KLK11的表達(dá)及其患者臨床病理參數(shù)對(duì)胰腺癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科2012年1月～2015年12月接收的實(shí)施根治性手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的胰腺癌組織(pancreatic carcinoma tissue，PCT)及其相配對(duì)的癌旁正常胰腺組織(non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma，Non-PCT)各75例。被研究者臨床資料完整，術(shù)前無(wú)放化療。其中：男44例，女31例；年齡36～ 79(62.17±9.02)歲，<60歲22例，≥60歲53例；胰頭癌、胰體尾癌分別為54例、21例；高、中低分化分別為14例、61例；直徑<2 cm者20例，≥2 cm的55例；惡性腫瘤分期(tumor node metastasis，TNM)Ⅰ期29例,Ⅱ期46例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移分別為48例、27例；神經(jīng)侵犯33例，未被侵犯42例。本研究已經(jīng)獲取醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可，全體病患均知情并且同意。

1.2主要試劑TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；KLK11一抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；二抗、IHC試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 分別提取PCT及Non-PCT各50 mg，提取總RNA為模板， 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。內(nèi)參照為GAPDH，上游引物：5’-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3’，下游引物：5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’，產(chǎn)物大小180 bp；KLK11引物序列上游引物: 5’-TGGCAACAGGGCTTGTAGGG-3’，下游引物: 5’-GTAGCCGCGTCTTCTCGAAC-3’，產(chǎn)物大小105 bp。

1.3.2Western blot 分別將PCT及Non-PCT按照1 ∶10添進(jìn)RIPA裂解液并使其完全分裂溶解，組織勻漿、超聲以及離心，提取上清液后檢測(cè)總蛋白濃度。上樣量均為 25 μl，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶室溫封閉之后，加入稀釋一抗(1 ∶1 000)，孵育洗滌后加入稀釋二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌后顯色、定影觀察。

1.3.3IHC 石蠟包埋標(biāo)本4 μm連續(xù)切片， 通過(guò)二甲苯脫蠟， 再水合并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌。而后微波加熱法將其置入檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，80 ℃保溫20 min完成抗原修復(fù)。依次滴加3% H2O2、一抗稀釋液(1 ∶200)，4 ℃溫育過(guò)夜，復(fù)溫后加入二抗，最后顯色、脫水后封片。根據(jù)整張病理切片低倍鏡視野下染色細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度半定量評(píng)估KLK11的表達(dá)。染色細(xì)胞百分比排列如下：0分為無(wú)染色，1分為1%～15%染色，2分為15%～45%染色，3分為>45%染色。細(xì)胞染色強(qiáng)度分為不同的評(píng)分：切片為棕黃色、黃色、淡黃色、未著色依次記成3、2、1、0分。染色細(xì)胞的百分比與染色強(qiáng)度兩項(xiàng)得分的乘積是最后得出的分?jǐn)?shù)，低于3則判定為表達(dá)較低，反之則為表達(dá)較高。全部切片的評(píng)估活動(dòng)都由兩名具有豐厚經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師共同開(kāi)展，二者對(duì)于對(duì)方的評(píng)估互不知曉。

2 結(jié)果

2.1PCT、Non-PCT中KLK11的mRNA表達(dá)利用qRT-PCR方法分別檢測(cè)配對(duì)的PCT及Non-PCT各10例，平均表達(dá)水平分別為(1.413±0.659)、(0.488±0.324)。PCT組KLK11 mRNA 的表達(dá)水平明顯高于Non-PCT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.979,P<0.01)。

2.2PCT、Non-PCT中KLK11的表達(dá)

2.2.1Western blot檢測(cè)KLK11的表達(dá)情況 分別檢測(cè)PCT及Non-PCT各10 例, PCT 組KLK11的表達(dá)明顯高于Non-PCT組，PCT 組KLK11相對(duì)表達(dá)量為1.83±0.18，顯著高于Non-PCT組(1.00±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組中KLK11的表達(dá)水平

2.2.2IHC檢測(cè)KLK11的表達(dá) 檢測(cè)75例PCT及相配對(duì)的Non-PCT，結(jié)果顯示PCT組KLK11陽(yáng)性表達(dá)的有58例(77.33%)，高于Non-PCT組(20%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 KLK11在PCT和Non-PCT中的表達(dá) SP×400

A：KLK11在PCT中的表達(dá)；B：KLK11在Non-PCT中的表達(dá)

2.3KLK11和胰腺癌患者臨床病理資料間的關(guān)聯(lián)性IHC表明KLK11的表達(dá)和胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM存在明顯的相關(guān)性(P<0.001)。但是和患者其余臨床資料之間無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表1。

表1 KLK11表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

2.4生存分析

2.4.1KLK11的表達(dá)與OS和DFS的關(guān)系 Kaplan-Meier分析顯示，KLK11在胰腺癌組織中高表達(dá)的無(wú)病生存期(disease-free survival，DFS)和總生存期(overall survival，OS)(平均DFS：7.217個(gè)月，平均OS：14.318個(gè)月)比KLK11低表達(dá)的DFS和OS(平均DFS：16.939個(gè)月，平均OS：22.776個(gè)月)顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

2.4.2KLK11的表達(dá)和胰腺癌患者臨床病理參數(shù)及胰腺癌預(yù)后的關(guān)系 單因素分析與OS和DFS相關(guān)的因素結(jié)果表明，KLK11在胰腺癌組織中的高表達(dá)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期與胰腺癌不良預(yù)后顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。而多因素分析結(jié)果表明KLK11在胰腺癌組織中的高表達(dá)是胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素[OS：風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio，HR)=4.903； 95%CI：1.641～14.649；P=0.004；DFS：HR=5.437； 95%CI：1.816～16.275；P=0.002)]。見(jiàn)表3。

3 討論

研究[4]表明，各類腫瘤診斷及監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物KLK受到的關(guān)注度日漸提升。被稱為前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)的KLK3在臨床中使用率較高，在前列腺癌的篩查中發(fā)揮著不可替代的作用[5]。KLK11是KLK基因家族成員之一，多種腫瘤中檢測(cè)到異常，包括前列腺癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌以及直腸癌在內(nèi)的許多癌癥中異常表達(dá)[6-7]。而KLK11在胰腺癌中的病理生理作用卻極少被提起。本研究借助對(duì)75例PCT與Non-PCT中KLK11的表達(dá)進(jìn)行IHC檢測(cè)，結(jié)果顯示KLK11的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)主要集中于PCT導(dǎo)管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)之中，而在Non-PCT導(dǎo)管細(xì)胞中卻沒(méi)有明顯的表達(dá)，雖然它在后者中的腺泡及胰島兩類細(xì)胞中有所表達(dá)，但是表達(dá)程度明顯弱于胰腺導(dǎo)管細(xì)胞。同時(shí)它的表達(dá)與胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有明顯的相關(guān)性(P<0.01)，但是和患者其余臨床資料之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性。Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示KLK11及其mRNA在PCT中的表達(dá)較高，而在Non-PCT中卻比較低。由此可見(jiàn)， KLK11在PCT導(dǎo)管細(xì)胞中的表達(dá)偏高，究其根本可能是和胰腺癌的發(fā)病存在一定的相關(guān)性。 另外，該研究通過(guò)Kaplan-Meier分析，結(jié)果表明KLK11高表達(dá)的生存時(shí)間比KLK11低表達(dá)的生存時(shí)間明顯縮短。進(jìn)一步通過(guò)分析KLK11的表達(dá)及其他臨床病理參數(shù)對(duì)胰腺癌預(yù)后的影響，單因素分析顯示KLK11在胰腺癌組織中的高表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期與胰腺癌不良預(yù)后具有一定的相關(guān)性，而通過(guò)COX回歸模型多因素分析得出的結(jié)論是KLK11在胰腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)是胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素。

圖3 Kaplan-Meier分析KLK11的表達(dá)與OS和DFS的關(guān)系

變量患者例數(shù)(n)OS中位生存期(月)χ2值P值DFS中位生存期(月)χ2值P值年齡(歲)0.0560.8130.0590.808 <602216.3677.467 ≥605315.8677.433性別3.2560.0714.7950.029 男4417.0338.133 女3115.7337.333腫瘤部位0.5650.4522.1210.145 頭部5416.1338.100 體尾部2115.7337.267腫瘤直徑(mm)3.0790.0792.7580.097 <202017.2678.267 ≥205515.3337.333分化程度0.9610.3270.9610.327 中低6115.4677.433 高1417.2679.333神經(jīng)侵犯0.0350.8520.1720.679 陰性4216.3677.900 陽(yáng)性3315.3337.333淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23.641<0.00126.924<0.001 陰性2720.36712.833 陽(yáng)性4815.1337.133TNM分期24.678<0.00128.698<0.001 Ⅰ2920.36710.600 Ⅱ4615.0337.033KLK1125.614<0.00129.837<0.001 低表達(dá)1727.46711.233 高表達(dá)5815.3337.233

表3 多因素分析與OS和DFS相關(guān)的因素

諸多惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及其預(yù)后都和KLK11存在密切的相關(guān)性。 Alexopoulou et al[8]采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)120例原發(fā)性結(jié)直腸腺癌患者的120例癌性和41例非癌性結(jié)直腸組織標(biāo)本進(jìn)行KLK11 mRNA表達(dá)研究，結(jié)果顯示結(jié)直腸腺癌組織當(dāng)中的KLK11轉(zhuǎn)錄物出現(xiàn)了明顯的增加。同時(shí)在對(duì)KLK11 mRNA表達(dá)和結(jié)直腸腺癌臨床病理特點(diǎn)之間的相關(guān)性加以探究之后，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)和腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)亞型以及分級(jí)都具有一定的相關(guān)性。KLK11 mRNA表達(dá)可被認(rèn)為是結(jié)直腸腺癌新的預(yù)后生物標(biāo)志物，對(duì)高侵襲性腫瘤和(或)淋巴結(jié)陽(yáng)性患者具有更高的預(yù)后價(jià)值。Unal et al[9-10]研究了KLK11在胃癌和非轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)組織中的表達(dá)情況。通過(guò)對(duì)55例手術(shù)和輔助放化療治療的胃癌患者的腫瘤組織進(jìn)行IHC切片。結(jié)果顯示在55例患者中，35例(63.6%)為KLK11表達(dá)陽(yáng)性，20例(36.4%)為KLK11表達(dá)陰性，KLK11陽(yáng)性患者的DFS和OS(DFS：24個(gè)月，OS：29個(gè)月)顯著高于KLK11陰性患者(DFS：11個(gè)月，OS：13個(gè)月)(P<0.05)。研究[9]表明胃癌中KLK11的陽(yáng)性表達(dá)可能是胃癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。在對(duì)44例NSCLC患者的研究中，同樣利用IHC方法檢測(cè)KLK11的表達(dá)，再通過(guò)Kaplan-Meier分析顯示KLK11強(qiáng)陽(yáng)性患者 DFS高于KLK11弱陽(yáng)性患者DFS(12個(gè)月/9個(gè)月，P=0.113)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 但KLK11強(qiáng)陽(yáng)性患者OS明顯高于KLK11弱陽(yáng)性患者OS(20個(gè)月/11個(gè)月，P=0.032)。多變量Cox回歸分析顯示KLK11在NSCLC患者中的強(qiáng)弱表達(dá)與患者OS顯著相關(guān)(P=0.032)。研究[10]推測(cè)KLK11也可能作為NSCLC的預(yù)后生物標(biāo)志物。

KLK11在諸多惡性腫瘤中發(fā)揮著不可替代的作用。本研究結(jié)果表明KLK11的異常表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)胰腺癌的轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)及其預(yù)后具有潛在應(yīng)用價(jià)值，但在胰腺癌中的作用機(jī)制還有待研究。后期課題組將通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因敲除技術(shù)深入研究KLK11在胰腺癌中發(fā)揮的作用。