李澤蓮，楊媛媛，韋雯雯，何 靜，顏士杰，肖 蘭

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)病死率高居女性生殖系統(tǒng)腫瘤首位，確診時(shí)多處于晚期，相對(duì)其他婦科腫瘤，惡性程度高，III期EOC患者其5年生存率為23%～41%，對(duì)于IV期癌癥患者僅為11%[1]。卵巢癌化療耐藥是制約其臨床療效、導(dǎo)致其遠(yuǎn)期生存率低的關(guān)鍵[2]。腫瘤微環(huán)境變化與腫瘤侵襲、進(jìn)展和耐藥密切相關(guān)，而腫瘤組織中液泡膜-ATP酶(vacuolar membrane-ATPase,V-ATPase)表達(dá)過(guò)量或活性增高是形成腫瘤酸性微環(huán)境重要原因之一[3]。Ki-67是與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，有研究[4]顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者卵巢癌組織中Ki-67表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，且陽(yáng)性率高，Ki-67表達(dá)越高，患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞增殖速率越快，更易侵襲而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。目前V-ATPase在EOC中表達(dá)的臨床意義以及與Ki-67表達(dá)相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)免疫組化方法分析V-ATPase和Ki-67在EOC中表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討兩者在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)和意義。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2015年1月～2016年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的75例EOC患者的病理標(biāo)本(術(shù)前均未行放化療或生物治療)。經(jīng)病理科確診后收集其完整的臨床病理資料。實(shí)驗(yàn)組：年齡(54.15±8.03)歲，卵巢腫瘤按照FIGO的分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期60例。卵巢腫瘤按照WHO組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為：漿液性腺癌32例，黏液性腺癌38例，其他類(lèi)型5例。并同期收取非卵巢疾病患者手術(shù)切除的正常卵巢組織40例，年齡(52.09±7.32)歲。標(biāo)本的收集均獲得患者的知情并簽訂知情同意書(shū)。有完整的隨訪資料。

1.2方法將患者的臨床病理資料，如年齡、病理類(lèi)型、臨床分期、腫瘤分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、腫瘤大小與V-ATPase表達(dá)進(jìn)行比較。并選用Ki-67作為腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物，采用免疫組織化學(xué)進(jìn)行檢測(cè)。石蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片，切片厚4 μm，切片進(jìn)行抗原修復(fù)，經(jīng)過(guò)脫蠟、脫二甲苯、3% H2O2封閉和枸櫞酸修復(fù)液微波修復(fù)后，一抗V-ATPase-D1(1 ∶500) 、Ki-67(1 ∶600)(美國(guó)Santa Cruz公司)孵育4 ℃過(guò)夜，次日復(fù)溫后，抗兔二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，顯微鏡下加DAB(5%)顯色。經(jīng)蘇木精復(fù)染、乙醇化、脫水和中性樹(shù)膠封片，并在室溫風(fēng)干后光鏡下觀察。以在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕褐色細(xì)顆粒狀為陽(yáng)性。免疫組織化學(xué)結(jié)果依據(jù)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為V-ATPase蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)于每例均隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野(×200)，鏡下未觀察到陽(yáng)性細(xì)胞為陰性(-)，鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為弱陽(yáng)性(1+)，鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%為陽(yáng)性(2+)，鏡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>25%為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher′s確切概率法進(jìn)行比較，V-ATPase與Ki-67關(guān)系應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EOC組織過(guò)表達(dá)V-ATPase如圖1所示，EOC組織的胞膜及胞質(zhì)中均有V-ATPase陽(yáng)性染色，見(jiàn)棕黃色染色，且著色明顯。但在正常卵巢上皮組織中，V-ATPase蛋白陽(yáng)性著色淡，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞膜不表達(dá)。EOC組織陽(yáng)性表達(dá)率與正常卵巢上皮組織V-ATPase蛋白陽(yáng)性表達(dá)率相比(61.3%vs12.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。相應(yīng)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞標(biāo)記抗原Ki-67表達(dá)與V-ATPase表達(dá)呈一致性(圖2)。

圖1 V-ATPase表達(dá) ×200

A：V-ATPase在正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)為(-)；B～D：V-ATPase在EOC中的表達(dá)程度分別為弱陽(yáng)性(1+)、陽(yáng)性(2+)、強(qiáng)陽(yáng)性(3+)

2.2V-ATPase表達(dá)與EOC臨床病理的關(guān)系V-ATPase表達(dá)與EOC患者的年齡、病理類(lèi)型、脈管浸潤(rùn)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與EOC FIGO分期(P=0.002)、病理分級(jí)(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.020)以及腫瘤大小(P=0.015)有明顯相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3EOC中V-ATPase和Ki-67的相關(guān)性分析經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，V-ATPase與Ki-67蛋白在EOC中呈正相關(guān)性(rs=0.238，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 正常卵巢上皮及EOC組織中V-ATPase及Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率比較(n)

圖2 Ki-67表達(dá) ×200

A：Ki-67在正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)為(-)；B～D：Ki-67在EOC中分別為弱陽(yáng)性(1+)、陽(yáng)性(2+)、強(qiáng)陽(yáng)性(3+)

表2 V-ATPase的表達(dá)與EOC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 EOC組織 V-ATPase與Ki-67蛋白的關(guān)系(n)

3 討論

目前，卵巢癌仍是威脅女性生殖健康的主要惡性疾病，其發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，雖然卵巢癌臨床治療技術(shù)已顯著提高，但由于不能早期診斷及術(shù)后化療耐藥，總的5年生存率仍無(wú)明顯改善。因此，從分子水平上研究卵巢癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找合理有效的治療靶點(diǎn)，是提高卵巢癌生存率、延長(zhǎng)生存期、改善生活質(zhì)量的關(guān)鍵。

V-ATPase位于腫瘤細(xì)胞小泡的膜，如溶酶體膜、高爾基體的囊泡膜以及植物液泡膜上，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH值，將腫瘤細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生的大量H+泵出細(xì)胞外，維持腫瘤細(xì)胞的生存及其酸性微環(huán)境。研究[5-6]表明腫瘤微環(huán)境影響微血管形成、腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)放療、化療的敏感性，尤其是酸性微環(huán)境與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥都有關(guān)。

本研究中75例EOC組織中V-ATPase陽(yáng)性表達(dá)率為61.3%，在腫瘤細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)，同期正常卵巢上皮組織中陽(yáng)性表達(dá)僅為12.5%，故推測(cè)V-ATPase高表達(dá)與EOC發(fā)生有關(guān)。分析V-ATPase表達(dá)與EOC臨床病理特征的關(guān)系，顯示V-ATPase表達(dá)與EOC患者年齡、病理類(lèi)型無(wú)明顯相關(guān)，而與腫瘤FIGO分期相關(guān)(V-ATPase陽(yáng)性表達(dá)率Ⅰ～Ⅱ期為26.7%vsⅢ～Ⅳ期為70%)，提示EOC分期越晚，V-ATPase陽(yáng)性表達(dá)率越高，V-ATPase過(guò)表達(dá)亦與EOC的發(fā)展呈正相關(guān)性。本研究中V-ATPase表達(dá)與EOC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織的分化程度以及腫瘤大小均顯示顯著相關(guān)，提示EOC V-ATPase 高表達(dá)的腫瘤增殖較快，較容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有動(dòng)物研究[6]提示，在無(wú)胸腺的小鼠腹腔里種植卵巢癌細(xì)胞，紫杉醇加奧美拉唑聯(lián)合治療相比單用紫杉醇，腫瘤體積明顯降低；另有研究[7]表明抑制V-ATPase 可誘導(dǎo)Bnip3依賴(lài)的腫瘤細(xì)胞死亡，從而降低腫瘤負(fù)荷和轉(zhuǎn)移。本研究及以上結(jié)論均表明V-ATPase高表達(dá)與瘤體體積相關(guān)。卵巢腫瘤病灶體積<5 cm直徑時(shí)CA125不易被檢測(cè)到，因而推論V-ATPase比CA125具有更強(qiáng)的靈敏性和特異性。最近的研究[8-10]提示V-ATPase在乳腺癌及胃腸道惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲起著重要作用。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，是反映惡性腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要分子標(biāo)志物，幾乎表達(dá)于所有增殖細(xì)胞, 與腫瘤增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切。本研究顯示，V-ATPase過(guò)表達(dá)病例中Ki-67指數(shù)亦呈增高趨勢(shì)，V-ATPase和Ki-67抗原表達(dá)呈明顯正相關(guān)性，即V-ATPase表達(dá)水平越高，腫瘤細(xì)胞增殖越活躍。V-ATPase導(dǎo)致腫瘤酸性微環(huán)境形成，該環(huán)境促進(jìn)EOC細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。故認(rèn)為Ki-67可能是V-ATPase調(diào)控腫瘤酸性微環(huán)境形成, 腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖標(biāo)志之一。

V-ATPase異常表達(dá)使得腫瘤酸性微環(huán)境得以產(chǎn)生及維持，目前以V-ATPase為靶點(diǎn)，糾正腫瘤酸性微環(huán)境已成為克服腫瘤耐藥的一種極具潛力的治療手段。Ki-67是一種判斷細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，將兩者結(jié)合起來(lái)，對(duì)于判斷EOC的預(yù)后和腫瘤靶向治療的效果極有意義。