王 劍，王 春，肖 峰，馬 勇，魏 偉

白芍總苷(total glucosides of paeony, TGP)提取于芍藥干燥根部，臨床長(zhǎng)期用藥證實(shí)TGP治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)(rheumatoid arthritis, RA)療效顯著，但起效較慢[1]。芍藥苷(paeoniflorin, Pae)是TGP的主要有效成分。研究[2]顯示Pae具有相同的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。由于其低親脂性的特性，Pae在口服后吸收較差，生物利用度極低 (3%～4%)[3]。因此課題組前期合成了一種新的Pae酯化衍生物苯芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯(benzene sulfonyl paeoniflorin) , 代號(hào)CP-25。課題組已有研究[4]表明CP-25具有良好的抗炎免疫和軟調(diào)節(jié)性能，其藥理學(xué)活性[3]和生物利用度[5]均高于Pae。在體單向腸灌流大鼠模型研究[6]表明CP-25吸收明顯高于Pae，被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是CP-25 在大鼠小腸中主要吸收機(jī)制。此外，前期研究[7]使用超高效液相質(zhì)譜 (UPLC-MS/MS) 方法測(cè)定CP-25大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示疾病狀態(tài)下的大鼠血漿中，CP-25在雌性大鼠體內(nèi)分布顯著大于雄性大鼠, 食物攝取顯著增強(qiáng)CP-25的吸收。然而，CP-25在Caco-2細(xì)胞中的吸收特性仍然不清楚。因此，該研究將探討CP-25在Caco-2細(xì)胞中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 CP-25:白色粉末狀，自制，純度>98%；DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；甲醇、乙腈為色譜級(jí)，購(gòu)于Merck公司； Transwell 12孔板購(gòu)自Corning公司；MTT購(gòu)自白鯊生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；GF120918購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度>95%；MK571購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度>95%；KO143購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度> 98%。

1.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 Caco-2細(xì)胞購(gòu)于ATCC (American Type Culture Collection)

1.1.3主要儀器 SW-CJ系列潔凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備工程有限公司；Agilent1200 高效液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司；AA-200DS 電子分析天平購(gòu)自Denver 儀器公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo；Millicell-ERS上皮跨膜細(xì)胞電阻儀購(gòu)自美國(guó)Millipore。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Caco-2細(xì)胞模型液CP-25定量分析方法的建立

1.2.1.1色譜條件及其專屬性 Agilent1200 高效液相色譜儀色譜儀；Aglient TC-C18(5 mm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇-水(53 ∶47)；柱溫:30 ℃；流速：0.8 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。在該條件下CP-25的色譜峰與相鄰峰基線分離度較好，峰形對(duì)稱。

1.2.1.2CP-25標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將CP-25儲(chǔ)備液溶液用HBSS液分別稀釋成1、2、5、10、20、40、80 μg/ml的質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋混合1 min，放置 15 min后，取上清液0.2 ml進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為Y，質(zhì)量濃度為 X(μg/ml)作線性回歸，計(jì)算相關(guān)回歸方程。

1.2.1.3CP-25穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取CP-25標(biāo)準(zhǔn)品，用HBSS液溶解并定容至10 μg/ml，置于37 ℃恒溫水浴槽中保溫，分別于0、0.5、1、1.5、2、3 h取樣渦旋混合1 min，放置 15 min后，取上清液0.2 ml按照1.2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行操作，記錄相應(yīng)峰面積。

1.2.1.4CP-25精密度實(shí)驗(yàn) 取線性范圍內(nèi)低(5 μg/ml)、中(10 μg/ml)、高(20 μg/ml)3個(gè)濃度樣品，按1.2.1.1項(xiàng)下操作，每個(gè)濃度樣品制備5份。同一樣品1 d內(nèi)測(cè)定5次的結(jié)果為日內(nèi)精密度，連續(xù)5 d測(cè)定同一樣品的結(jié)果為日間精密度。

1.2.1.5CP-25回收率實(shí)驗(yàn) 取CP-25線性范圍內(nèi)低(5 μg/ml)、中(10 μg/ml)、高(20 μg/ml) 3個(gè)濃度的樣品，按1.2.1.1項(xiàng)下操作并記錄峰面積。將CP-25峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即得CP-25的實(shí)際加入的濃度，以測(cè)定質(zhì)量濃度與加入質(zhì)量濃度之比計(jì)算回收率即得CP-25低、中、高3個(gè)濃度的回收率。另用流動(dòng)相制備相同濃度的CP-25樣品溶液，直接進(jìn)樣并記錄其峰面積，兩峰面積之比即為相對(duì)回收率。

1.2.2Caco-2細(xì)胞模型的建立

1.2.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞在含10 % FBS、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1%的鏈青霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃、相對(duì)濕度95%、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰酶按1 ∶3消化傳代，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為35～60代。

1.2.2.2Caco-2單細(xì)胞層的建立 將Caco-2細(xì)胞以密度為1×105個(gè)/ml接種在12孔Transwell小室上，AP側(cè)加0.5 ml細(xì)胞懸液， BL側(cè)加1.5 ml DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)21～23 d。

1.2.2.3TEER電阻值的測(cè)定 細(xì)胞在接種后的4、8、12、16、20、22 d分別用Millicell ERS-2細(xì)胞電阻儀測(cè)定細(xì)胞跨膜電阻值，按照下列公式計(jì)算跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance, TEER):TEER=(Rt-R0)×A(Ω·cm2)。其中Rt為細(xì)胞孔實(shí)測(cè)電阻值；R0為不含細(xì)胞空白電阻值；A為小室有效膜面積(1.12 cm2)。

1.2.3CP-25在Caco-2細(xì)胞模型上吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究[8]

1.2.3.1MTT法檢測(cè)CP-25對(duì)Caco-2單細(xì)胞層毒性 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caco-2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞密度接種到96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后取出原細(xì)胞培養(yǎng)基，再將不同濃度CP-25(0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/ml)加入細(xì)胞中孵育4 h。每孔加入20 μl MTT并孵育4 h，再每孔加入200 μl DMSO，用微型振蕩器振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀在492 nm處分析樣品。使用沒有接種細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，并且含有細(xì)胞但沒有樣品溶液的孔用作陰性對(duì)照。每組由3個(gè)復(fù)孔組成。細(xì)胞存活率用下式計(jì)算：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值 - 空白組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值 - 空白組OD值)×100%。

1.2.3.2不同濃度對(duì)CP-25轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 將CP-25溶解于HBSS培養(yǎng)基中，制備不同濃度的CP-25，分別為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/ml。細(xì)胞在不同濃度的CP-25 HBSS培養(yǎng)基中孵育2 h，2 h后分別在AP側(cè)和BL側(cè)吸取0.2 ml溶液按照1.2.1.1項(xiàng)下操作，記錄其峰面積。

1.2.3.3不同溫度對(duì)CP-25轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 將濃度為5、10、20 μg/ml的CP-25以0.5 ml體積分別加入AP側(cè)，并將1.5 ml HBSS培養(yǎng)基加入到BL側(cè)。 隨后將含藥細(xì)胞放置在4 ℃下培養(yǎng)2 h。2 h后，從每個(gè)樣品的BL側(cè)取出0.2 ml溶液按照1.2.1.1項(xiàng)下操作，記錄其峰面積。

1.2.3.4P-gp、MRP2和BCRP對(duì)CP-25轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 將CP-25用甲醇溶解并用HBSS培養(yǎng)基稀釋，其含藥稀釋液用于溶解GF-120918、MK-571和KO143。P-gp拮抗劑GF120918(100 μmol/L)[9]、MRP2拮抗劑MK-571(50 μmol/L)[10]和BCRP拮抗劑KO143(10 μmol/L)可評(píng)估其對(duì)CP-25和Pae的Papp的影響。選擇TEER高于500 Ω/ cm2的Caco-2細(xì)胞單層用于該實(shí)驗(yàn)。將0.5 ml和1.5 ml的藥物溶液分別加入到AP側(cè)和BL側(cè)。同時(shí)，分別向BL側(cè)和AP側(cè)添加1.5 ml和0.5 ml的HBSS。將樣品孵育2 h，然后分別從AP側(cè)和BL側(cè)取出0.4 ml和0.2 ml樣品溶液按照1.2.1.1項(xiàng)下操作，記錄其峰面積。

1.3表觀滲透系數(shù)(Papp)的計(jì)算[11]Papp值的大小反映了受試物吸收的程度和速度。Papp由下式計(jì)算：

其中，ΔQ/Δt為化合物單位時(shí)間內(nèi)的透過速率，A為細(xì)胞表面積，即為本模型中支持膜的面積(1.12 cm2)，C0為化合物初始濃度。Papp的單位常用cm/h或cm/s表示。

1.4表觀滲透率比(PDR)的計(jì)算[11]PDR是受試物從BL面到AP面和AP面搭配BL面之比，其大小反映了受試物吸收機(jī)制。PDR由下式計(jì)算：物質(zhì)在當(dāng)前色譜條件下無(wú)干擾，符合樣品分析方法的檢查要求。

其中，PappBL→AP從基底側(cè)到腸腔側(cè)(BL→AP)的Papp值，PappAP→BL從腸腔側(cè)到基底側(cè)的Papp值。

2 結(jié)果

2.1HPLC圖譜專屬性色譜圖見圖1，結(jié)果表明CP-25的保留時(shí)間為11.4 min，空白HBSS液和內(nèi)源

圖1 Caco-2細(xì)胞模型HBSS液(A)、CP-25供試液(B)的HPLC圖

2.2HPLC方法學(xué)小結(jié)HPLC測(cè)定Caco-2 細(xì)胞模型HBSS液中的CP-25,出峰時(shí)間11.6 min，出峰時(shí)間適宜，無(wú)明顯Caco-2模型內(nèi)溶液干擾。CP-25標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=24.403X-23.678(r2=0.999)，濃度范圍在1～80 μg/ml，線性關(guān)系良好，相對(duì)回收率>90%，日內(nèi)和日間RSD<5%，且在實(shí)驗(yàn)條件下(37±1)℃穩(wěn)定，均符合樣品分析要求。

2.3Caco-2細(xì)胞TEER值的測(cè)定Caco-2細(xì)胞接種Transwell小室后逐漸形成細(xì)胞單層，TEER值逐漸升高，22 d時(shí)達(dá)到(580±35)℃·cm2，表明此時(shí)細(xì)胞膜具有較強(qiáng)完整性，滿足轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)要求。見圖2。

圖2 Caco-2細(xì)胞在不同時(shí)期測(cè)定的TEER值

2.4CP-25對(duì)Caco-2單細(xì)胞層的毒性CP-25對(duì)Caco-2單細(xì)胞層的毒性結(jié)果如圖3所示，CP-25 在0.2～20 μg/ ml范圍48 h內(nèi)未見毒性。因此，本研究使用此范圍內(nèi)的濃度進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.5不同濃度對(duì)CP-25轉(zhuǎn)運(yùn)的影響結(jié)果如表1所示，CP-25的Papp值(AP→BL)在濃度為5、10、20 μg/ml時(shí)與2 μg/ml的CP-25組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CP-25 Papp(10-6cm/s) BL→AP值顯著高于Papp(10-6cm/s) AP→BL值，然而，CP-25 PDR值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明CP-25在Caco-2單細(xì)胞層中表現(xiàn)出濃度依賴性，并且CP-25的主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.6不同溫度對(duì)CP-25轉(zhuǎn)運(yùn)的影響結(jié)果如表2所示，與37 ℃ 時(shí)Papp(10-6cm/s)相比，4 ℃ 時(shí)CP-25 AP-BL的Papp值在5、10和20 μg/ ml時(shí)顯著降低(P<0.05，F(xiàn)=41.267)，提示主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)可能是CP-25在Caco-2細(xì)胞中的另一種吸收機(jī)制。

2.7P-gp、MRP2和BCRP對(duì)CP-25轉(zhuǎn)運(yùn)的影響P-gp抑制劑GF120918(100 μmol/L)、MRP2抑制劑MK571(50 μmol/L)和BCRP抑制劑KO143(10 μmol/L)對(duì)CP-25的Papp值如表3所示，與對(duì)照組 (不加抑制劑) 相比，GF120918和MK571 可使CP-25 Papp值增加約1.6和1.1倍，KO143對(duì)CP-25的Papp值沒有明顯影響；結(jié)果表明CP-25在Caco-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)有P-gp和MRP2參與，而與BCRP無(wú)關(guān)。此外，CP-25在Caco-2細(xì)胞中的PDR值小于1.5，表明CP-25主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖3 CP-25對(duì)Caco-2單細(xì)胞層的毒性

組別CP-25(μg/ml)251020Papp(10-6 cm/s)AP→BL0.98±0.051.09±0.03*1.12±0.05*1.37±0.06*Papp(10-6 cm/s)BL→AP0.56±0.04#0.73±0.02#0.91±0.02#1.22±0.04#PDR0.570.670.810.88

與2 μg/ml CP-25 Papp(10-6cm/s) AP→BL組比較：*P<0.05；與CP-25 Papp(10-6cm/s)AP→BL組比較：#P<0.05

表2 Caco-2細(xì)胞單層模型中溫度對(duì)CP-25轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

與37 ℃ CP-25 Papp(10-6cm/s)組比較：*P<0.05

表3 Caco-2細(xì)胞單層模型中P-gp、MRP2和BCRP對(duì)CP-25轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

與CP-25 (10 μg/ml) BL→AP組比較：*P<0.05,**P<0.01

3 討論

良好的口服吸收是新藥篩選的先決條件，藥物溶解度和胃腸道的滲透性是影響口服吸收的主要因素。一般來(lái)說(shuō)，藥物溶解度和滲透性與其物理化學(xué)性質(zhì)如親脂性、分子大小、氫鍵強(qiáng)度和電離強(qiáng)度有關(guān)。然而，預(yù)測(cè)人的口服吸收卻相對(duì)復(fù)雜，特別是在早期藥物開發(fā)階段。一些體外實(shí)驗(yàn)方法廣泛用于新藥的篩選和藥物相關(guān)吸收機(jī)制的研究，Caco-2細(xì)胞體外分化成類似人的腸上皮細(xì)胞時(shí)可表達(dá)腸道特有的水解酶[12]，此外Caco-2細(xì)胞表達(dá)P-gp和其他膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平與人的腸上皮細(xì)胞表達(dá)水平相當(dāng)。因此，Caco-2細(xì)胞模型常常用于研究藥物在人的腸細(xì)胞中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。本研究探討了不同濃度和溫度對(duì)CP-25在Caco-2細(xì)胞模型上吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，并通過GF120918、MK571和KO143 考察CP-25在Caco-2細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是否與P-gp、MRP2和BCRP三種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)。結(jié)果顯示CP-25的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨著CP-25濃度的增加而增加，Papp(BL→AP)均顯著低于Papp(AP→BL)，說(shuō)明藥物在吸收過程中盡管會(huì)有藥物外排，但總體趨勢(shì)依舊是吸收，藥物濃度越高，總體吸收程度越高。此外，CP-25 (2、5、10、20 μg/ml)在Caco-2細(xì)胞雙向轉(zhuǎn)運(yùn)中的PDR值均小于1.5，說(shuō)明CP-25主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn),這一結(jié)論與之前的報(bào)道[6]一致。

載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)溫度十分敏感，載體是存在于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，只有在合適的溫度條件下才具有生物活性。本實(shí)驗(yàn)在4 ℃ 條件下時(shí)，CP-25和Pae(5、10、20 μg/ml)的Papp(AP→BL)值與37 ℃ 條件下Papp(AP→BL)值相比顯著降低，其原因可能是低溫導(dǎo)致載體蛋白失活，因此主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)可能是CP-25在Caco-2細(xì)胞中的另一種吸收機(jī)制。此外，也可能是由于CP-25微溶于水，藥物在低溫條件下可能會(huì)析出結(jié)晶，導(dǎo)致培養(yǎng)體系中CP-25實(shí)際濃度降低，從而Papp(AP→BL)值降低。

P-gp、MRP2和BCRP是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中研究最多的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[13]。通常，口服給藥必須穿過腸上皮細(xì)胞才能到達(dá)血液和組織，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白充當(dāng)選擇性屏障，將藥物外排到腸腔中。因此， ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)體可抑制口服給藥吸收性，是導(dǎo)致多藥耐藥性的主要因素。已有文獻(xiàn)[14]報(bào)道P-gp、MRP2和BCRP在人的空腸和Caco-2細(xì)胞中表達(dá)豐富。Vaidyanathan et al[10]研究發(fā)現(xiàn)P-gp抑制劑GF120918、MRP2抑制劑MK571和BCRP抑制劑KO143可有效抑制三種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果表明GF-120918和MK571 可使Papp(AP→BL)顯著增加，Papp(BL→AP)顯著降低，KO143對(duì)雙向Papp均無(wú)顯著差異，提示CP-25為外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、MRP2的底物，而不是BCRP的底物。課題組前期研究[6]表明CP-25均不是P-gp、MRP2和BCRP的底物。這一相悖結(jié)果可能是它們所用抑制劑的濃度 (GF120918 5.6 μg/ml，MK571 5.3 μg/ml，KO143 0.5 μg/ml)與其他報(bào)道[15]所用抑制劑濃度相比太低,不能對(duì)P-gp抑制作用產(chǎn)生很大影響造成的。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投加衅渥陨淼木窒扌?，不能僅僅依賴于單一實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头椒▉?lái)確認(rèn)其底物。

綜上所述，CP-25主要吸收機(jī)制是被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的參與。CP-25是P-gp和MRP2的底物，不是BCRP的底物，這一研究發(fā)現(xiàn)為提高CP-25生物利用度提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。