余學(xué)釗，汪 洋，葉 琦，陶 瑜

缺血性心臟病是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠狀動(dòng)脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，其中最常見的原因?yàn)楣跔顒?dòng)脈粥樣硬化引起的冠狀動(dòng)脈狹窄和閉塞，約占缺血性心臟病的90%左右。冠心病多發(fā)生于40歲以上，其患病率及病死率均隨年齡而上升[1];我國人口基數(shù)大，正面臨人口老齡化的嚴(yán)峻形勢(shì)，近年來冠心病的發(fā)病人數(shù)逐年增多,給社會(huì)經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生系統(tǒng)都帶來了極大負(fù)擔(dān)[2]。

多肽是指含少量氨基酸的小分子蛋白，近年來的研究已表明多肽在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，但多肽在缺血性心臟病中的研究尚少[3-4]。之前的研究對(duì)低氧培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞與常氧培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記法(TMT)檢測(cè)，篩選出一批顯著差異表達(dá)的多肽[5]。通過生物信息學(xué)對(duì)其功能聚類分析，從中挑選出表達(dá)明顯上調(diào)的多肽pPRDX5tide作為研究對(duì)象，探討其在缺血性心臟病中的可能作用。以大鼠心肌細(xì)胞H9c2為研究對(duì)象，通過兩種低氧應(yīng)激模型：① 低氧袋誘導(dǎo)的無氧環(huán)境；② 在培養(yǎng)上清液中加入CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞低氧損傷[6-7]。分別檢測(cè)心肌損傷相關(guān)指標(biāo)，評(píng)估多肽對(duì)心肌低氧的保護(hù)作用。該研究擬檢測(cè)pPRDX5tide在H9c2細(xì)胞不同低氧損傷模型中的作用，探究其在缺血性心臟病中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 DMEM(批號(hào)：8117278)、無糖DMEM(批號(hào)：8117165)、PBS(批號(hào)：311010035)、trypsin胰酶(批號(hào)：1760553)、胎牛血清(FBS,批號(hào)：AC10248326)、P/S青霉素/鏈霉素(批號(hào)：1864874)購自美國Gibco公司；AnaeroPack(批號(hào)：7097ZJ-3)購自日本Mitsubishi Gas Chemical公司；CoCl2(批號(hào)：2016.04.29 )購自天津科密歐公司；乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C0017-5)、臺(tái)盼藍(lán)染色試劑盒(批號(hào)：S0033)、活性氧檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0033)購自廣東碧云天生物技術(shù)有限公司；Caspase3抗體(批號(hào)：360758)、PARP抗體(批號(hào)：GR119170-6)、β-actin抗體(批號(hào)：110603)購自美國Abcam公司；實(shí)驗(yàn)所用H9c2細(xì)胞株購自美國菌種保藏中心ATCC。

1.1.2多肽 多肽序列：DSLVSLF；穿膜序列：RKKRR-QRRR-A；pPRDX5tide：RKKRRQRRR-A-DS-LVSL由上海科肽生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1H9c2細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞為大鼠心肌細(xì)胞，用含有10% FBS和1% P/S的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞低氧 物理低氧：以六孔板接種細(xì)胞，待密度達(dá)到70%～80%后，低氧組換成無糖無血清的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組換成DMEM完全培養(yǎng)基，分別以不同濃度(10、20、50 μmol/L)pPRDX5tide預(yù)處理H9c2細(xì)胞，2 h后，低氧組置于低氧箱中按條件進(jìn)行低氧10 h。

化學(xué)低氧：以6孔板接種細(xì)胞，待密度達(dá)到70%～80%后，在正常培養(yǎng)基中按條件加入不同濃度(10、20、50 μmol/L)的pPRDX5tide預(yù)處理H9c2細(xì)胞，2 h后，低氧組加入模擬物CoCl2使終濃度為700 μmol/L進(jìn)行24 h化學(xué)低氧。

1.2.3乳酸脫氫酶的活性檢測(cè) 吸取細(xì)胞培養(yǎng)基，8 000 r/min離心5 min，96孔板每孔加入樣品120 μl和工作液60 μl,室溫孵育30 min后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm下的吸光度。

1.2.4臺(tái)盼藍(lán)染色 收集所有的H9c2細(xì)胞，按照臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行染色，染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞死亡率=藍(lán)色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的檢測(cè) 低氧結(jié)束后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積的用無血清DMEM 1 ∶1 000稀釋的DCFH-DA,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，無血清DMEM洗滌細(xì)胞3次，直接在熒光顯微鏡下觀察并對(duì)各組隨機(jī)選取區(qū)域進(jìn)行拍攝。

1.2.6Western blot 用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞后，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，取適量RIPA裂解蛋白，收取裂解液，制樣后進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫分析。

2 結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析對(duì)前期的多肽組學(xué)結(jié)果中差異較大的前體蛋白(P<0.05,變化倍數(shù)>2)進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)分析(圖1A)，結(jié)果顯示，較多基因聚類于細(xì)胞凋亡的負(fù)性調(diào)控、細(xì)胞與細(xì)胞的黏附、mRNA的加工與處理。其中，凋亡過程(apoptotic process)有較高的富集，已知凋亡在心肌細(xì)胞早期損傷中扮演著重要角色，再對(duì)其中聚類的蛋白進(jìn)一步進(jìn)行熱圖分析(圖1B)，從中挑選出差異顯著的 pPRDX5tide作進(jìn)一步生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)pPRDX5tide(共7個(gè)氨基酸序列)，前體蛋白為過氧化物酶5(peroxiredoxin 5, PRDX5) (213個(gè)氨基酸序列)，pPRDX5tide位于前體蛋白序列中的第166～172個(gè)氨基酸位點(diǎn)處，參與凋亡過程的調(diào)節(jié)，在小鼠和人中均具有較高的保守性(圖1C)。

圖1 多肽組數(shù)據(jù)分析及pPRDX5tide的生物信息學(xué)分析

圖2 pPRDX5tide保護(hù)物理低氧造成的損傷

A:物理低氧造模；與對(duì)照組比較：***P<0.001；B：物理低氧模型下，pPRDX5tide對(duì)LDH釋放的作用；與低氧組比較：##P<0.01,###P<0.001

2.2pPRDX5tide降低乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)的活性通過應(yīng)用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)細(xì)胞的損傷作用。結(jié)果顯示：采用低氧袋處理10 h和700 μmol/L CoCl2處理24 h分別進(jìn)行物理和化學(xué)低氧造模的方法,檢測(cè)LDH釋放量(OD490 nm)，物理低氧(1.667±0.031)較正常對(duì)照組(1.017±0.021)以及化學(xué)低氧(加入400、700 μmol/L CoCl2的LDH釋放量分別為：1.481±0.030、1.924±0.28)較正常對(duì)照組(1.028±0.021)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見均可對(duì)H9c2細(xì)胞造成損傷(圖2A、3C)。加入不同濃度的pPRDX5tide(10、20、50 μmol/L)可呈濃度依賴性地抑制細(xì)胞中LDH的釋放(分別為1.486±0.043、1.333±0.039、1.322±0.027)(圖2B、3D)，且在50 μmol/L濃度時(shí)的作用最為明顯。綜上所述，pPRDX5tide可降低LDH的活性水平及釋放，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

2.3pPRDX5tide提高細(xì)胞的存活率應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞存活率的檢測(cè)。結(jié)果顯示：低氧后，細(xì)胞的死亡率明顯增加(0.415±0.019)，常氧情況下，細(xì)胞死亡率為(0.074±0.009)，加入pPRDX5tide后并不影響細(xì)胞的存活率，死亡率為(0.095±0.012)，對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用，而在低氧時(shí)，pPRDX5tide能明顯降低細(xì)胞的死亡率(0.204±0.023)(圖3A、3E)。所以，pPRDX5tide能提高細(xì)胞的存活率，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

2.4pPRDX5tide降低ROS水平應(yīng)用雙氯熒光素(DCFH-DA)染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示：常氧情況下，pPRDX5tide對(duì)ROS水平無影響，熒光強(qiáng)度基本不變,見圖3D(c)、3F(c)；低氧時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)，熒光強(qiáng)度明顯增加,見圖3D(b)、3F(b)。濃度為50 μmol/L pPRDX5tide能明顯抑制低氧時(shí)產(chǎn)生的大量ROS，使得熒光強(qiáng)度較低氧時(shí)明顯降低，該濃度時(shí)熒光強(qiáng)度降低也最為明顯[圖3D(d)、3F(d)]，pPRDX5tide能抑制低氧對(duì)ROS水平的促進(jìn)作用。

2.5pPRDX5tide降低凋亡蛋白的水平Caspase3和PARP活化時(shí)能產(chǎn)生切割帶，表明凋亡的激活，pPRDX5tide呈劑量依賴性的抑制凋亡蛋白Caspase3和PARP的活化，濃度越大,凋亡蛋白活化的表達(dá)水平越低，50 μmol/L時(shí)作用最為明顯，切割帶的表達(dá)水平最低，即50 μmol/L pPRDX5tide抑制凋亡的效果最佳(圖4A)。這表明，pPRDX5tide參與細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)，具有抗凋亡作用，能降低低氧造成的心肌細(xì)胞的凋亡。

3 討論

pPRDX5tide是從低氧新生大鼠心肌細(xì)胞中選擇的表達(dá)上調(diào)的多肽。對(duì)新生大鼠低氧心肌細(xì)胞與未低氧心肌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)顯示：pPRDX5tide在低氧心肌細(xì)胞中顯著增高，利用H9c2細(xì)胞的物理與化學(xué)低氧模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示pPRDX5tide能抑制H9c2細(xì)胞的凋亡，降低低氧狀態(tài)下H9c2細(xì)胞的死亡率，上述結(jié)果表明pPRDX5tide對(duì)心肌低氧損傷有一定的保護(hù)作用。

作為細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)分子，細(xì)胞內(nèi)源性多肽已受到越來越多的關(guān)注。一般認(rèn)為，多肽作為其前體蛋白的水解產(chǎn)物，常保留其一部分空間結(jié)構(gòu)及作用位點(diǎn)，在生物功能上能夠通過激活、拮抗其前體蛋白的作用靶點(diǎn)發(fā)揮與前體蛋白相似或相反的生物功能[8]。在研究中，通過生物信息學(xué)分析表明pPRDX5tide定位于 PRDX5的第166個(gè)至172個(gè)氨基酸，全長7個(gè)氨基酸，研究[9-10]顯示PRDX5參與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等多種生物過程。目前已有研究[11]顯示PRDX5可通過一系列的氧化還原反應(yīng)保護(hù)線粒體DNA免受氧化應(yīng)激的損傷、抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。pPRDX5tide是否通過影響PRDX5的靶點(diǎn)功能來抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受低氧損傷，需進(jìn)一步檢測(cè)PRDX5的下游信號(hào)活性變化以及p53信號(hào)通路的激活情況，并通過挽救策略，深入論證其具體的作用機(jī)制。

圖3 pPRDX5tide保護(hù)不同模式的低氧損傷并抑制ROS的產(chǎn)生

A：物理低氧模型下，pPRDX5tide對(duì)細(xì)胞死亡率的影響；與低氧組比較：**P<0.01；B：化學(xué)低氧造模合適條件；與0 μmol/L組比較：##P<0.01,###P<0.001；C：化學(xué)低氧模型下，pPRDX5tide對(duì)細(xì)胞死亡率的影響；與低氧組比較：▽P<0.05；D:物理低氧模型下，pPRDX5tide對(duì)活性氧的作用(×200；a：正常培養(yǎng)條件；b：物理低氧條件下；c：常氧下，pPRDX5tide預(yù)處理；d：物理低氧條件下，pPRDX5tide預(yù)處理)； E：化學(xué)低氧模型下，pPRDX5tide對(duì)乳酸脫氫酶釋放的作用；與低氧組比較：△△△P<0.001；F：化學(xué)低氧模型下，pPRDX5tide對(duì)活性氧的作用(×200；a：正常培養(yǎng)條件；b：化學(xué)低氧條件下；c：常氧下，pPRDX5tide預(yù)處理；d：化學(xué)低氧條件下，pPRDX5tide預(yù)處理)

本文研究了pPRDX5tide對(duì)H9c2細(xì)胞低氧損傷的保護(hù)作用，論述了pPRDX5tide與缺血性心臟病之間的相關(guān)性。研究結(jié)果可能為探究缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新思路，為缺血性心臟病的防治提供新的分子靶點(diǎn)。

圖4 pPRDX5tide抑制氧化損傷中凋亡關(guān)鍵蛋白的活化