劉國東，張 雪，林 群，方 強(qiáng)，單深良，謝 坤，劉付寶

肝細(xì)胞肝癌是肝臟腫瘤最常見的類型，其死亡率高，占腫瘤相關(guān)性死因的第三位[1]。全球每年有500 000例以上新診斷的患者，其中約50%來自中國[2]。盡管肝移植、手術(shù)切除和局部消融等治療方式改善了早期肝癌的預(yù)后，但肝癌的整體預(yù)后仍不理想，因為大多數(shù)患者診斷時已處于晚期階段。索拉菲尼(sorafenib，Sor)是FDA批準(zhǔn)的晚期肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，藥物的反應(yīng)率有所限制。二甲雙胍(metformin，Met)是2型糖尿病的常見治療藥物，它的抗腫瘤作用被廣泛研究，結(jié)果表明，Met可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及增加化療和靶向藥物的敏感性[3]。該研究將探討Met與Sor聯(lián)合對肝癌細(xì)胞HepG2增殖及凋亡的影響，為肝癌的有效治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料肝癌細(xì)胞株HepG2由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗室饋贈；Sor購于美國MCE生物公司；二甲雙胍、DMSO、MTT購于美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基購自英國Hyclone 公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購于上海貝博生物公司；胎牛血清、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自北京碧云天生物公司；免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑ECL購自美國Millipore 公司；抗β-actin抗體、抗Erk抗體、抗p-Erk抗體、抗Akt抗體、抗p-Akt抗體購于美國CST公司；抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠和抗兔二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將HepG2細(xì)胞株復(fù)蘇后培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中，使用的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM。定期換液(1～2 d/次)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞長至80%左右胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，用于實驗。

1.3MTT檢測Met及Sor對HepG2細(xì)胞增殖的影響實驗分為空白組、陰性對照組、藥物組。將HepG2細(xì)胞(密度1×105個/ml)均勻接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后作相應(yīng)處理，Met組藥物濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L。Sor組藥物濃度為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，聯(lián)合組取上述各單藥組濃度組合。72 h后加入5 mg/ml的MTT液(20 μl/孔)，避光孵育4 h后棄上清液，加入DMSO(200 μl/孔)，震動10 min，于酶標(biāo)儀上讀取490nm和655 nm雙波長處的吸光度(optical density，OD)值，計算增殖抑制率，抑制率(%)=[1- (實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。計算單藥的半數(shù)抑制濃度(IC50)及兩藥聯(lián)合時的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)，CI<1表示兩種藥物有協(xié)同效應(yīng)，CI=1表示兩種藥物有相加效應(yīng)，CI>1表示兩種藥物有拮抗效應(yīng)。后續(xù)各實驗取IC50作為單藥及聯(lián)合給藥的藥物濃度。實驗重復(fù)至少3次。

1.4熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化將細(xì)胞懸液均勻接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至60%左右時，對照組細(xì)胞僅換液，實驗組包括Met組(10 mmol/L)、Sor組(6 μmol/L)、Met+Sor組(10 mmol/L+6 μmol/L)，藥物處理24 h后PBS洗滌2次，每孔依次加入Annexin V結(jié)合液500 μl、AnnexinV-FITC 5 μl,避光孵育10～15 min，再加入10 μl PI染液，避光孵育5 min，顯微鏡下觀察光鏡及熒光鏡下細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，拍照記錄。

1.5流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞凋亡率實驗分組及處理同1.4項，藥物處理24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，按細(xì)胞凋亡試劑說明書進(jìn)行FCM檢測，F(xiàn)lowJo7.6.1軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.6Westernblot檢測p-Erk、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平將上述4組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，制備蛋白樣品，配膠上樣，SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠80 V，20 min；分離膠120 V，80 min)，轉(zhuǎn)膜(220 mA，100 min)，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗室溫孵育1 h或者4 ℃過夜，洗膜3次(10 min/次)，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次(10 min/次)，加入ECL發(fā)光液，暗室中顯影、定影，烘干保存膠片。

2 結(jié)果

2.1Met、Sor及雙藥聯(lián)合對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用MTT法結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖抑制率隨著藥物濃度的升高而升高，Met和Sor單藥作用72 h的IC50分別為(9.87±1.52)mmol/L和(5.65±0.71)μmol/L(圖1)。計算各濃度單藥聯(lián)合時的CI值，結(jié)果均小于1，提示Met與Sor聯(lián)合具有協(xié)同作用，制作效應(yīng)(Fa)-聯(lián)合指數(shù)(CI)圖(圖2)。

2.2熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化與對照組相比，Met與Sor處理組可見明顯處于早期凋亡的細(xì)胞(綠色熒光)；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡更加顯著，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見增多的濃染的紅色熒光(晚期凋亡)，貼壁細(xì)胞數(shù)量大量減少，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變瘦，呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征(圖3)。

2.3FCM檢測各組細(xì)胞凋亡率各組細(xì)胞作用24 h后，Met、Sor及聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率分別為(13.94±0.40)%、(16.54±0.09)%、(42.09±1.12)%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 536.00，P<0.01)(圖4)。

2.4Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組相比，Met及Sor單藥均可一定程度地降低p-Erk蛋白、 p-Akt蛋白及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，兩藥聯(lián)合上述效應(yīng)更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=195.08、38.87、40.47、487.95，P<0.01)(圖5)。

圖1 MTT法檢測Met和Sor對HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖2 Met和Sor對HepG2細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)

圖3 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 ×400

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率

圖5 Western blot檢測p-Erk、p-Akt、Bcl-2、Bax等蛋白表達(dá)水平

3 討論

近年來，Met的潛在抗腫瘤作用被廣泛報道，包括肝細(xì)胞肝癌， 研究[4-6]表明，Met與化療或放療等方式聯(lián)合應(yīng)用于多種腫瘤細(xì)胞中具有協(xié)同效應(yīng)，在并且可能增強(qiáng)放療介導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌的凋亡作用、逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的多藥耐藥性。Bhalla et al[7]的研究顯示，食用含有Met食物組的小鼠患肝癌的比例比對照組低57%，服藥后仍患腫瘤的小鼠其腫瘤平均體積比對照組小37%，說明Met對肝癌的預(yù)防和治療具有一定作用。

Met主要通過活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)進(jìn)而下調(diào)m-TOR信號通路發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[8]。mTOR蛋白是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、細(xì)胞周期等多個方面扮演著重要角色，mTOR的上游信號傳導(dǎo)途徑主要有兩條：① 經(jīng)典的PI3K/Akt/mTOR信號通路。PI3K可被激活的Ras通路以及一些生長因子及細(xì)胞因子激活，進(jìn)而激活A(yù)kt，活化的Akt可以直接磷酸化mTOR[9]。② 非依賴PI3K/Akt 途徑:越來越多的研究顯示AMPK與mTOR的活性調(diào)節(jié)有關(guān)。另外，Met可通過胰島素樣生長因子(insulin like growth factor,IGF)及其下游信號分子抑制腫瘤生長，Met可抑制腸道細(xì)胞吸收葡萄糖發(fā)揮降糖作用，有效降低胰島素水平，通過胰島素樣生長因子1(IGF-1)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖[10-11]。而PI3K/Akt/mTOR信號通路為胰島素樣生長因子受體(IGFR)下游一條重要信號通路，故Met也可通過抑制IGFR來抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而抑制mTOR信號通路。

該研究將Met與Sor聯(lián)合，結(jié)果顯示兩者均可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)，熒光染色法觀察兩藥聯(lián)合后細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化較單藥組更加明顯，Western blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)減弱，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)Met及Sor單藥均可降低p-Erk和p-Akt的表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用上述效果更顯著。Met可通過減少肝糖原異生，增加周圍組織對胰島素的敏感性、抑制腸道細(xì)胞吸收葡萄糖發(fā)揮降糖作用，有效降低胰島素水平，通過抑制IGFR信號通路進(jìn)而抑制p-Akt，使細(xì)胞增殖受到抑制，發(fā)生凋亡，并且Met還可抑制線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的功能，使ATP合成減少，AMP水平升高，間接激活A(yù)MPK[12]。Sor是一個多靶點(diǎn)的小分子激酶抑制劑，它可以通過抑制Raf激酶、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR) 和血小板衍生生長因子(PDGF)等多個途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。該研究發(fā)現(xiàn)Sor可直接抑制Raf/MEK/ERK信號通路，降低p-Erk的表達(dá)，并且其可能通過抑制Ras/Raf的活性繼而抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路。

本研究結(jié)果證實Met和Sor聯(lián)合可共同抑制PI3K/Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK信號通路，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，為肝癌新的治療方式提供理論依據(jù)，然而，藥物的抗腫瘤機(jī)制十分復(fù)雜，是否有其他機(jī)制參與其中尚需進(jìn)一步研究。