王 兵，顏琳琳，關(guān)江鋒，胡作為，王 珊，侯 煒

惡性胸腔積液(malignant pleural effusion，MPE)是肺癌常見的并發(fā)癥之一[1]?？梢詫?dǎo)致患者胸悶、氣促、咳嗽、胸痛、呼吸困難，影響心肺功能，加快腫瘤擴(kuò)散，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。據(jù)統(tǒng)計(jì)肺腺癌MPE患者的中位總生存期僅為14.3～21.4個(gè)月[2]。臨床上惡性腫瘤一旦合并胸腔積液，就意味著病變已局部或全身擴(kuò)散，預(yù)后極差，是手術(shù)不能治愈的晚期疾病標(biāo)志，此時(shí)治療的主要目的是有效地控制胸腔積液，緩解臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，延長生存期。中醫(yī)藥以其獨(dú)特的優(yōu)勢，在MPE的治療中逐漸發(fā)揮了重要作用，近年來許多學(xué)者進(jìn)行了大量中醫(yī)藥治療MPE的臨床研究[3-4]，表明中醫(yī)藥在治療MPE方面確實(shí)具有一定優(yōu)勢，但是有關(guān)作用機(jī)制研究卻較少開展。

中藥消水方是中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科沿用多年的經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床研究顯示中藥消水方口服聯(lián)合順鉑胸腔灌注治療MPE 65例，有效率達(dá)72.3%，并能明顯緩解臨床癥狀，提高免疫功能，延長生存時(shí)間[5-6]。水通道蛋白(aquqporin，AQPs)是近年來發(fā)現(xiàn)的在機(jī)體水液代謝中起著重要作用的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[7]，到目前為止共發(fā)現(xiàn)13個(gè)亞型，AQP 0～12存在于人體的多個(gè)組織器官[8]，研究[9-10]顯示AQP1在小鼠胸膜間皮細(xì)胞上廣泛表達(dá)，且在MPE的產(chǎn)生中也發(fā)揮了重要作用。因此推測消水方可能通過影響AQP1表達(dá)從而發(fā)揮抑制MPE的作用, 該研究通過建立小鼠肺癌MPE模型，采用消水方干預(yù)后檢測胸膜AQP1表達(dá)，深入探討中藥抑制MPE的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物及細(xì)胞株SPF級6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，(20±2)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，許可證號：SCXK(京)2004-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院清潔級動物中心，許可證號：SYXK(京)2005-0001。所有動物在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前均環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以上。帶有熒光標(biāo)記的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株(C57BL/6來源)由美國國立癌癥研究所惠贈。

1.2藥物中藥消水方組成：葶藶子30 g，生黃芪15 g，刺五加15 g，醋莪術(shù)10 g，炒白術(shù)15 g，黃芩10 g，大棗15 g，全瓜蔞15 g，徐長卿15 g，半枝蓮30 g，車前子30 g，茯苓15 g等。各藥物均由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥房提供，并經(jīng)該院藥劑科王麗霞主任藥師鑒定為正品。分別5、2.5倍水量煎煮2次，混合過濾，蒸發(fā)濃縮制成1 g生藥/ml藥液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑熒光素酶底物D-Luciferin購自冷泉港生物科技股份有限公司；異氟烷購自河北九派制藥有限公司；TRIzol Reagent、UltraPure Agarose、High Capacity RNA-to-cDNA Kit、TapMan Gene Expression Master Mix、TaqMan Gene Expression Assays均購自美國Life Technologies公司；兔抗鼠AQP1抗體、β-actin內(nèi)參抗體均購自美國Abcam公司；山羊抗兔IgG-HRP、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、PVDF膜、BeyoECL Plus均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.4主要儀器IVIS Lumina II小動物活體成像系統(tǒng)購自美國Caliper公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)購自美國Thermo Scientific公司；Progene PCR 擴(kuò)增儀購自英國Techene公司；Applied Biosystems 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；水平電泳槽、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)移槽、電泳儀、Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀購自北京六一儀器廠；Synergy HT型酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司；3-30K型高速冷凍離心機(jī)購自美國Sigma公司；TS100型光學(xué)倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；MCO-18AIC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司。

1.5方法

1.5.1小鼠肺癌胸腔積液模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 小鼠肺癌胸腔積液模型參照文獻(xiàn)[11-12]方法并加以改良：Lewis肺癌細(xì)胞復(fù)蘇后加入培養(yǎng)液置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收集處于對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入PBS緩沖液調(diào)整細(xì)胞終濃度為2.5×106/ml。接種前用75%酒精消毒小鼠胸部右側(cè)皮膚，用1 ml注射器吸取細(xì)胞懸液，輕輕搖動使細(xì)胞混勻，從小鼠右側(cè)胸部靠近腋中線，約平第6肋間隙，針頭向上與胸壁成30°夾角，注射入胸腔，接種量為2.5×106/ml的細(xì)胞懸液0.2 ml/鼠?？瞻捉M小鼠于同一位置胸腔內(nèi)注射相同體積的PBS緩沖液。活體成像可見小鼠胸腔熒光隨著時(shí)間推移逐漸增強(qiáng)，并且解剖發(fā)現(xiàn)小鼠右側(cè)胸腔存在血性胸水及魚肉色腫瘤結(jié)節(jié)即為造模成功。取45只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為中藥組、模型組、空白組，按照上述方法造模，建模第3天后按如下給藥：中藥組：以33.5 g/(kg·d)生藥藥液，調(diào)整至0.2 ml予小鼠灌胃，1次/d；模型組：給予0.2 ml的生理鹽水灌胃，1次/d；空白組：給予0.2 ml的生理鹽水灌胃，1次/d。建模當(dāng)天為第1天，3 d后即第4天起開始給藥，總共用藥10 d，第14天處死取材。

1.5.2活體成像動態(tài)觀察胸腔熒光變化 三組各隨機(jī)選取5只小鼠，分別于第3、8、13天時(shí)進(jìn)行小鼠活體成像觀察。實(shí)驗(yàn)時(shí)將熒光素酶底物置于室溫融化，小鼠稱重后，以10 μl底物/1g 鼠濃度計(jì)算每只小鼠所需底物體積，然后將相應(yīng)體積熒光素酶底物注入小鼠腹腔內(nèi)，35 min后置于小動物活體成像儀器內(nèi)測量胸腔積液及胸壁熒光值。以腫瘤接種天數(shù)為橫坐標(biāo)，單位面積熒光值為縱坐標(biāo)，繪制胸腔積液及移植瘤體內(nèi)生長曲線。

1.5.3取材并測定胸腔積液體積 給藥觀察期結(jié)束后，過量麻醉處死小鼠，仰臥位進(jìn)行解剖，沿腹中線暴露腹腔，剝離肝臟，暴露橫膈膜，觀察有無胸水形成，沿胸骨中線剪開胸壁，以1 ml注射器抽取雙側(cè)胸腔積液并準(zhǔn)確記錄其體積。將整個(gè)胸壁剪下，固定于解剖板上，手術(shù)尖刀切割壁層胸膜，置于-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)檢測。

1.5.4RT-PCR檢測壁層胸膜AQP1 mRNA表達(dá) 取100 mg壁層胸膜組織，采用TRIzol法，通過勻漿、裂解、分離相、沉淀、洗滌、溶解等步驟提取胸膜中總RNA，使用超微量分光光度計(jì)測定RNA的濃度與純度，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其完整性。配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作手冊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。檢測基因采用TapMan Gene Expression Assays的預(yù)混基因，包括待測基因AQP1(ID：Mm01326466_m1)，內(nèi)參基因GAPDH(ID：Mm99999915_g1)。將cDNA、待測基因與TapMan Gene Expression Master Mix混勻，轉(zhuǎn)移至光學(xué)反應(yīng)板上，覆蓋光學(xué)反應(yīng)膜，運(yùn)行PCR反應(yīng)程序，導(dǎo)出相對定量數(shù)據(jù)。以相對表達(dá)量(2-ΔΔCt)值表示目的基因mRNA表達(dá)。

1.5.5Western blot檢測壁層胸膜AQP1蛋白表達(dá) 取壁層胸膜組織100 mg，加入RIPA裂解液，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度并調(diào)整蛋白濃度一致，取等量蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，加AQP1(β-actin作為內(nèi)參)一抗4 ℃孵育過夜，洗滌，二抗室溫孵育1 h，洗滌，ECL超敏化學(xué)發(fā)光法顯色，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One軟件導(dǎo)出圖片，并對各組條帶光密度值進(jìn)行分析。相對光密度值=處理組目標(biāo)蛋白光密度值/處理組內(nèi)參蛋白光密度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠不同時(shí)間胸腔熒光水平空白組小鼠胸腔全程未見熒光出現(xiàn)，中藥組和模型組小鼠在第3天時(shí)行活體成像觀察可見兩組熒光強(qiáng)度基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第8天成像時(shí)兩組熒光強(qiáng)度開始表現(xiàn)出一定差異，但也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第13天成像時(shí)中藥組熒光強(qiáng)度明顯低于模型組熒光強(qiáng)度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。

2.2各組小鼠胸腔積液量各組小鼠在給藥觀察期內(nèi)均未見死亡，解剖發(fā)現(xiàn)空白組小鼠胸腔內(nèi)壁光滑，未發(fā)現(xiàn)胸腔積液及胸壁移植瘤，如圖3A、3B所示。而模型組和中藥組小鼠胸腔均可見油膩性的血性胸腔積液，胸壁上多發(fā)腫瘤結(jié)節(jié)，小者呈顆粒樣聚集，大者呈團(tuán)塊狀生長，如圖3C、3D、3E、3F所示。測量小鼠胸腔積液體積，結(jié)果顯示中藥組明顯小于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，空白組無胸腔積液生成。見圖4。

2.3各組小鼠壁層胸膜AQP1mRNA表達(dá)水平中藥組和模型組小鼠壁層胸膜AQP1 mRNA表達(dá)水平較空白組均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而中藥組相比于模型組小鼠能明顯降低AQP1 mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

圖1 各組小鼠活體成像時(shí)胸腔熒光圖

圖3 各組小鼠胸腔解剖圖

圖2 各組小鼠胸腔熒光值變化折線圖

1：中藥組；2：模型組；3：空白組；與模型組比較：*P<0.01

2.4各組小鼠壁層胸膜AQP1蛋白表達(dá)水平模型組小鼠壁層胸膜AQP1蛋白表達(dá)水平顯著高于空白組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中藥組與模型組相比，能顯著下調(diào)壁層胸膜AQP1蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖6。

圖5 各組小鼠壁層胸膜AQP1 mRNA表達(dá)情況

1：中藥組；2：模型組；3：空白組；與空白組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.01

3 討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為MPE形成的主要機(jī)制為腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜，刺激胸膜引起炎性反應(yīng)，使臟壁層毛細(xì)血管通透性增高，大量液體滲出，或腫瘤組織阻塞淋巴管，而致淋巴液流體靜壓升高，影響淋巴液的回流[13]。但隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)以及免疫學(xué)的迅猛發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)胸膜自身以及胸膜腔局部腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、微血管等相互作用形成的微環(huán)境在MPE的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色，主要機(jī)制包括Ang1/2(血管生成素1/2)[14]、IL-6/Stat3通路[15]、CXCR4/CXCL12趨化軸[16]、AQPs[10]、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[17]、Th17/Treg[18-19]細(xì)胞平衡等。

圖6 各組小鼠壁層胸膜AQP1 蛋白表達(dá)情況

1：中藥組；2：模型組；3：空白組；與空白組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.01

其中AQPs家族中的AQP1是一類分子質(zhì)量相對較低的膜內(nèi)嵌蛋白，其所介導(dǎo)的自由水快速被動的跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)是水進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑。AQP1表達(dá)在壁層和臟層胸膜表面，基本功能是維持胸膜腔中的液體流入與流出平衡，腫瘤微環(huán)境可能導(dǎo)致AQP1表達(dá)異常，影響毛細(xì)血管和間質(zhì)的液體交換，引起胸腔滲透壓改變，形成MPE，并且AQP1表達(dá)量與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)性。因此本研究通過建立肺癌胸腔積液小鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠壁層胸膜AQP1 mRNA及蛋白表達(dá)相比于空白組小鼠均顯著升高，這與文獻(xiàn)[9-10]研究結(jié)果相符，證實(shí)肺癌MPE小鼠胸膜存在AQP1表達(dá)的失常。

MPE的中醫(yī)治療手段比較豐富，主要有中藥復(fù)方口服、中藥注射劑靜滴或胸腔灌注及中藥外敷等，而中藥口服最能體現(xiàn)中醫(yī)特色，具有多層次、多靶標(biāo)的特點(diǎn)，在治療MPE中發(fā)揮著整體調(diào)節(jié)作用。如王玨 等[20]發(fā)現(xiàn)瀉肺逐飲湯可以降低MPE大鼠胸水和胸膜組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、AQP1、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、VEGF等的含量，同時(shí)提高穿孔素(PFP)的表達(dá)，從而抑制MPE生成。吳君 等[21]發(fā)現(xiàn)解氏肺癌二號方一方面可能通過降低小鼠血清VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)含量，阻斷腫瘤血管生成，并降低血管通透性，減少積液滲出；另一方面還可上調(diào)白介素-2(IL-2)和γ干擾素(IFN-γ)表達(dá)，提高其免疫活性，增強(qiáng)免疫功能，達(dá)到防治MPE作用。

中藥消水方是一張臨床治療MPE的有效經(jīng)驗(yàn)方，本方主要由生黃芪、白術(shù)、茯苓、葶藶子、大棗、車前子、刺五加、醋莪術(shù)、全瓜蔞、徐長卿、半枝蓮、黃芩等組成，以扶正培本為主，同時(shí)兼顧治氣、治水、治血、抗癌四個(gè)層面，具有益氣健脾、瀉肺利水、祛瘀抗癌功用，適用于正虛邪盛，水濕瘀結(jié)為患之MPE。采用該方對肺癌小鼠MPE進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示消水方具有良好的抑制MPE生成的作用，相比于模型組(715±61)μl，中藥組MPE體積僅為(268±79)μl，且中藥組胸腔活體成像熒光強(qiáng)度明顯低于模型組熒光強(qiáng)度，表明消水方不僅能夠減少M(fèi)PE，同時(shí)還可能對Lewis肺癌細(xì)胞本身具有一定抑制作用。

研究[22]顯示本方的主要利水組分葶藶大棗瀉肺湯可顯著降低肺癌MPE模型小鼠壁層胸膜間皮細(xì)胞AQP1及其mRNA表達(dá)水平，從而減少M(fèi)PE形成。該研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了消水方抑制MPE的分子機(jī)制，采用RT-PCR及Western blot檢測了各組小鼠壁層胸膜AQP1 mRNA以及蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示中藥組相比于模型組小鼠能明顯降低壁層胸膜AQP1 mRNA表達(dá)，同時(shí)下調(diào)AQP1蛋白表達(dá)。表明中藥消水方可能通過下調(diào)壁層胸膜間皮細(xì)胞AQP1表達(dá)，促進(jìn)胸腔MPE的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制MPE的形成。