余南榮，曾 祥，徐厚巍，藍(lán)俊松

胃癌是消化系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著社會(huì)的發(fā)展，胃癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，甚至有年輕化的傾向[1]。目前在臨床上，針對(duì)胃癌主要的治療手段是手術(shù)治療為主的綜合治療，化療能夠在一定程度上縮小腫瘤體積、減慢胃癌的發(fā)展速度，為患者爭(zhēng)取更多的手術(shù)機(jī)會(huì)。但胃癌是各類惡性腫瘤中化療敏感性較差的種類之一，對(duì)化療藥物的多藥耐藥是引起化療效果差的主要原因[2]。近年來(lái)針對(duì)胃癌耐藥性的研究[3]顯示，膜聯(lián)蛋白A2基因(Annexin A2，ANXA2)在胃癌細(xì)胞中顯現(xiàn)出異常表達(dá)，推測(cè)其有可能與胃癌的耐藥有關(guān)。該研究對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染，觀察胃癌耐藥細(xì)胞的藥物敏感性變化以及細(xì)胞中信號(hào)通路激活狀態(tài)的變化情況。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料順鉑(DDP)購(gòu)自山東德州制藥廠；MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；Bcl2多克隆抗體、AKT多克隆抗體、p-AKT(磷酸化-ANKT)多克隆抗體、P38多克隆抗體以及p-P38多克隆抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購(gòu)自Santa Cruz公司；ANXA2-siRNA及PCR引物合成自上海生物工程有限公司；SGC-7901/DDP耐藥細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；RNApure超純總RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京Biomed公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購(gòu)自北京TransGen Biotech公司。3131型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；凝膠成像儀UV-254購(gòu)自美國(guó)基因公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Headquarters；電泳儀、垂直電泳槽等購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901/DDP耐藥細(xì)胞接種于含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基配比為RPMI1640培養(yǎng)液中加入10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和鏈霉素。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%～100%融合時(shí)，吸去培養(yǎng)液后用PBS清洗3遍后加入0.25%的胰蛋白酶充分消化，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿，丟棄消化液后加入培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打形成細(xì)胞懸液后進(jìn)行傳代。選擇無(wú)污染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)處理方法，將細(xì)胞分為三組：空白對(duì)照組、空白-siRNA組、ANXA2-siRNA組。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)基置換成不含胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液。將siRNA加入至250 μl不含胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中，將10 μl陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM加入另一250 μl不含胎牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液中靜置5 min后將兩者混合，室溫下放置20 min后加入至各組細(xì)胞的培養(yǎng)基中，6 h后再次更換培養(yǎng)液。

1.2.3細(xì)胞總RNA提取及RT-PCR 采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，按1 ml/10 cm2培養(yǎng)皿貼壁細(xì)胞加入TRIzol，裂解液經(jīng)氯仿抽提(每1 ml TRIzol 加0.2 ml)后，用RNApure超純總RNA快速提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。過(guò)程如下：取5.0 μg總RNA，加入1 μl Oligo(dT)，2×ES reaction mix 10 μl，esayscriptRT/RI enzyme mix 1 μl,補(bǔ)無(wú)核糖核酸酶游離水至20 μl，42 ℃孵育30 min，然后85 ℃ 5 min失活easyscript RT。分裝后-20 ℃保存。β-actin、GST、Bax反應(yīng)體系如下：Mix 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物 0.5 μl，cDNA 1 μl，補(bǔ)ddH2O至20 μl。然后95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠鑒定。引物序列參見(jiàn)表1。重復(fù)10次，然后采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

表1 引物序列

1.2.4細(xì)胞蛋白提取及Western blot分析 在各組直徑100 mm平皿中，在生長(zhǎng)良好的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中加入200～300 μl 85 ℃的1×SDS凝膠加樣緩沖液(50 mmol/L Tris-Cl，pH 6.8；100 mmol/L DTT；2%SDS；10%甘油；0.1%溴酚藍(lán))裂解細(xì)胞；裂解樣品經(jīng)煮沸、超聲、離心后，取上清液，紫外光譜檢測(cè)定量，-20 ℃分裝保存。將50 μg樣品加入1×SDS凝膠加樣緩沖液，100 ℃變性10 min，順序加樣，行12%的SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，經(jīng)濕式電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)恒流冰浴轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶4 ℃封閉1 h；分別孵育一抗后，在4 ℃過(guò)夜。加入羊抗鼠或羊抗兔二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。觀察雜交信號(hào)。重復(fù)10次，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.5MTT分析 將各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化制作成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后，按照1×104個(gè)/孔的數(shù)量將200 μl細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)6個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)基更換為含有不同濃度DDP(0、2、4、8、10 μg/L)、5-氟尿嘧啶(5-FU)(0、2、4、8、10 μg/L)的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h后，每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入150 μl DMSO后室溫下水平震蕩10 min后采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處每孔的吸光度，取平均值，測(cè)定每組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

2 結(jié)果

2.1胃癌耐藥細(xì)胞耐藥相關(guān)基因表達(dá)ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP細(xì)胞后，無(wú)論在RNA水平還是蛋白水平上，耐藥相關(guān)基因GST的表達(dá)水平顯著降低，而B(niǎo)ax的表達(dá)水平明顯上調(diào)，見(jiàn)圖1、2和表2、3。

圖1 GST、Bax在RNA水平的表達(dá)變化

圖2 GST、Bax在蛋白水平的表達(dá)變化

項(xiàng)目空白對(duì)照空白-siRNAANXA2-siRNAF值P值GST灰度201.16±8.98202.98±7.4791.98±7.247.560.000Bax灰度133.63±6.16132.03±5.74153.98±9.6714.820.001

表3 GST、Bax在蛋白水平的表達(dá)變化的灰度分析

表4 MTT藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 MAPK及PI3K/Akt信號(hào)通路激活變化的灰度分析

2.2MTT藥敏實(shí)驗(yàn)與空白對(duì)照組和空白-siRNA組細(xì)胞相比，ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)化療藥物DDP和5-FU的IC50值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.3ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MAPK及PI3K/Akt信號(hào)通路激活的影響與空白對(duì)照組和空白-siRNA組細(xì)胞相比，ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901/DDP細(xì)胞后，MAPK信號(hào)通路中，P38表達(dá)無(wú)明顯變化，但P38磷酸化水平下降明顯。在PI3K/Akt信號(hào)通路中，AKT表達(dá)無(wú)明顯變化，但AKT磷酸化水平下降明顯。見(jiàn)圖3、表5。

圖3 MAPK及PI3K/Akt信號(hào)通路激活變化

3 討論

3.1ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞藥物敏感性的影響胃癌的發(fā)病率高，但早期診斷率低，患者就診時(shí)往往已處于進(jìn)展期胃癌，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，化療成為主要的治療手段。但胃癌細(xì)胞在化療過(guò)程中對(duì)化療藥物的敏感性不同，甚至?xí)a(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療的效果不佳[4]。胃癌耐藥細(xì)胞的出現(xiàn)是胃癌化療中棘手的問(wèn)題之一。促進(jìn)胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，降低耐藥性，是目前研究的熱點(diǎn)。

胃癌的耐藥機(jī)制目前仍不明確，可能涉及多種耐藥基因如P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(Topo-Ⅱ)等[5-7]。GST在生理狀態(tài)下能夠通過(guò)催化藥物與谷胱甘肽的結(jié)合，參與藥物的代謝，主要有堿性、中性、酸性三種類型。其中酸性GST在多種耐藥腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常[8]。目前認(rèn)為GST能夠使結(jié)合到谷胱甘肽上的化療藥物增加，從而使藥物外流減少而降低了細(xì)胞毒性，在鉑類、蒽環(huán)類藥物的耐藥性產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用[9]。Bax是Bcl-2家族中主要的促細(xì)胞凋亡蛋白。細(xì)胞凋亡信號(hào)激活Bax后，Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，使線粒體滲透性變化，影響細(xì)胞氧化還原作用，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[10]。本研究ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌耐藥細(xì)胞后顯示，耐藥基因GST的表達(dá)量明顯下降，而促細(xì)胞凋亡基因Bax表達(dá)量升高，這說(shuō)明胃癌細(xì)胞的耐藥性發(fā)生改變。進(jìn)一步采用MTT藥敏實(shí)驗(yàn)法分析胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)一線化療藥物DDP和5-FU的敏感性，結(jié)果顯示ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染后，半數(shù)致死量藥物濃度明顯下降，細(xì)胞對(duì)DDP和5-FU的敏感性顯著升高。有可能ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染后，更多的化療藥物進(jìn)入胃癌細(xì)胞內(nèi)，從而提高了藥物的殺傷能力。

本研究結(jié)果結(jié)合其他相關(guān)研究，推測(cè)ANXA2與胃癌的耐藥性具有密切的關(guān)系，降低胃癌耐藥細(xì)胞中ANXA2的表達(dá)，能夠改善胃癌耐藥的現(xiàn)狀。ANXA2與胃癌的關(guān)系密切，多項(xiàng)研究[11-12]已經(jīng)證實(shí)ANXA2在胃癌組織中異常高表達(dá)，甚至在胃癌的腫瘤分化、轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)中也起到重要作用。也許將ANXA2作為解決胃癌耐藥性問(wèn)題的切入點(diǎn)能夠取得突破性進(jìn)展。

3.2ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞信號(hào)通路激活的影響細(xì)胞內(nèi)存在多種信號(hào)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理病理過(guò)程。ANXA2是一種膜聯(lián)蛋白，能夠與多種不同的磷脂蛋白結(jié)合，參與多個(gè)信號(hào)通路的激活或抑制，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。在鼻咽癌的研究中顯示ANXA2能夠調(diào)控上皮間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，如果靶向下調(diào)ANXA2的表達(dá)能夠降低鼻咽癌的發(fā)生和對(duì)化療藥物的耐藥性[13]。如前所述，在本研究中轉(zhuǎn)染ANXA2-siRNA，下調(diào)胃癌耐藥細(xì)胞的ANXA2表達(dá)后，胃癌耐藥細(xì)胞中的耐藥相關(guān)基因表達(dá)量明顯下降，促凋亡基因表達(dá)量明顯升高，胃癌耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性大大提高。

本研究將MAPK及PI3K/Akt信號(hào)通路作為研究點(diǎn)，以探討ANXA2影響胃癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制。MAPK信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶通路，主要起到將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的作用，在信號(hào)通路中，多種蛋白激酶發(fā)生磷酸化而發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)的作用，其中P38及其磷酸化是非常關(guān)鍵的步驟[14]。PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌的發(fā)生、治療中起著橋梁的連接作用，PI3K在一系列上游信號(hào)的作用下，通過(guò)AKT等多種下游信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、對(duì)藥物的敏感性等[15]。將胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP進(jìn)行ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染后，MAPK信號(hào)通路中雖然P38表達(dá)量無(wú)變化，但磷酸化的P38水平明顯下降。同樣在PI3K/Akt信號(hào)通路中，雖然AKT表達(dá)量無(wú)明顯變化，但磷酸化的AKT表達(dá)明顯下調(diào)，這說(shuō)明ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)MAPK及PI3K/Akt信號(hào)通路的激活具有一定的影響。因此，ANXA2可能通過(guò)MAPK及PI3K/Akt信號(hào)通路改變胃癌耐藥細(xì)胞的化療藥物敏感性。

綜上，ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌耐藥細(xì)胞能夠下調(diào)胃癌耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，降低胃癌細(xì)胞的耐藥性，其機(jī)制可能是通過(guò)影響MAPK及PI3K/Akt信號(hào)通路中P38和AKT磷酸化過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。