韓曈曈，徐艷雪，朱友明，陳喬爾

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸但無(wú)蛋白編碼功能的RNA，研究[1-2]證實(shí)lncRNA參與細(xì)胞周期、凋亡、分化等多種細(xì)胞內(nèi)生物過程。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種lncRNA在腫瘤中異常表達(dá)，并且扮演著“癌基因”或“抑癌基因”的角色，如lncRNA HOTAIR、lincRNA-p21、lincRNA-ROR[3-5]。c-Myc是一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝、蛋白合成等重要生命活動(dòng)，研究[6]表明c-Myc在一些腫瘤中過表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并證實(shí)lncRNA可能在c-Myc誘導(dǎo)調(diào)控的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。鑒于c-Myc與lncRNA在腫瘤進(jìn)展過程中的密切聯(lián)系，將c-Myc相關(guān)的lncRNA作為研究的切入點(diǎn)，利用高通量測(cè)序技術(shù)在c-Myc tet off的H1299細(xì)胞中(在該系統(tǒng)中加入Doxycydine后c-Myc會(huì)下調(diào))進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)一些c-Myc正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的lncRNA，從中選擇了一個(gè)表達(dá)差異顯著且由c-Myc負(fù)調(diào)控的新lncRNA，命名為lncRNA55(ENST00000448595,lncRNA-AC109826.2)，確定作為后續(xù)研究對(duì)象。lncRNA55定位于人類2號(hào)染色體上，長(zhǎng)約548個(gè)核苷酸，目前關(guān)于腫瘤中l(wèi)ncRNA55生物學(xué)功能的報(bào)道較少。該研究旨在驗(yàn)證c-Myc和lncRNA55二者表達(dá)之間的相關(guān)性，并通過shRNA技術(shù)敲低lncRNA55以探究其對(duì)舌鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為舌鱗癌的分子靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料人舌鱗癌細(xì)胞系SCC3、人胚胎腎細(xì)胞293T、大腸桿菌DH5α(安徽醫(yī)科大學(xué)口腔實(shí)驗(yàn)室保存)；10%FBS、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液、青-鏈霉素溶液(美國(guó)Gibco公司)；該實(shí)驗(yàn)所用的表達(dá)載體plko.1-shc-Myc及對(duì)照組plko.1-shc-Myc-ctrl、flag-c-Myc及對(duì)照組flag空載(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生科院提供)；表達(dá)載體plko.1-shlncRNA55及對(duì)照組plko.1-shlncRNA55-ctrl(該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)；shlncRNA55、對(duì)照組shctrl質(zhì)粒、PCR引物(上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成)；載體質(zhì)粒plko.1及慢病毒包裝質(zhì)粒pRev、pGag、pVsvg(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室提供)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)；慢病毒包裝試劑(上海和元技術(shù)有限公司)；蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司)；Actin抗體、c-Myc兔單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)CST9402，1 ∶1 000)；硝酸纖維素膜(美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司)；RNA提取試劑盒(美國(guó)Promega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑(日本TaKaRa公司)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；DNA片段回收試劑盒、離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒(美國(guó)Axygen公司)；LB培養(yǎng)基為1%氯化鈉，1%蛋白胨，0.5%酵母提取物(上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑、嘌呤霉素、結(jié)晶紫(美國(guó)Sigma公司)；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。高壓蒸汽滅菌鍋(日本Hirayama公司)；恒溫干燥箱；數(shù)顯三用水浴箱(上海訊博公司)；高速常溫離心機(jī)、Master cycler PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；二氧化碳孵箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SCC3、293T細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2Plko.1-shlncRNA55表達(dá)載體的構(gòu)建 結(jié)合plko.1載體特點(diǎn)，由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)plko.1-shlncRNA55載體構(gòu)建所需的引物，上游引物：5′-CCGGGAAGCTCATTTTGTCAGCACTCGAGTG CTGACAAAATGAGCTTCTTTTTG-3′；下游引物：5′-A ATTCAAAAAGAAGCTCATTTTGTCAGCACTCGAGTG CTGACAAAATGAGCTTC-3′,合成shlncRNA55。獲得擴(kuò)增基因后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離并純化，回收目的片段。限制內(nèi)切酶37 ℃水浴雙酶切基因片段和質(zhì)粒載體plko.1，由T4連接酶將回收的酶切產(chǎn)物和載體連接。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂于LB(含Amp抗性)平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取菌落，篩選陽(yáng)性克隆，送公司測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建plko.1-shlncRNA55。

1.2.3慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染SCC3細(xì)胞 慢病毒包裝：過程中所需三種包裝質(zhì)粒為pRev、pGag、pVsvg。胰酶消化293T細(xì)胞，鋪至6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞密度50%時(shí)，分別取上述已構(gòu)建成功攜帶目的片段的表達(dá)載體(2 μg)和病毒包裝質(zhì)粒(2 μg pRev、2 μg pGag、1 μg pVsvg)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集病毒上清液，0.45 μm PVDF濾器過濾，病毒原液分裝，-80 ℃保存。慢病毒轉(zhuǎn)染：病毒感染前1 d，胰酶消化SCC3細(xì)胞，鋪6孔板，待細(xì)胞密度30%時(shí)，將各病毒液分別感染SCC3，同時(shí)加入2 μl的8 μg/ml polybrene，37 ℃孵育4 h，加入嘌呤霉素篩選1～2周。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)lncRNA55的表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染后48 h共6組SCC3細(xì)胞(轉(zhuǎn)染plko.1-shc-Myc、flag-c-Myc、plko.1-shlncRNA55及其各對(duì)照組)，按TRIzol試劑說明書分別提取各組細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。lncRNA55上游引物: 5′-GTGGGAGCAAATTAGTAGGTG-3′,下游引物:5′-CACTTCTGCCATCAGCATGCA-3′；GAPDH內(nèi)參：上游引物：5′-AGGAAGAGCACAAGGAAGGCA-3′,下游引物：5′-GGTTGCACATAGACGAGGACT-3′。將含有待擴(kuò)增序列的cDNA 為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)， 30 μl總體積包括:上游引物1 μl， 下游引物1 μl，cDNA 1 μl，2× Pfu PCR MasterMix 15 μl， 無(wú)菌蒸餾水12 μl。在PCR擴(kuò)增儀上完成PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃、2 min，94 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃、2 min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄各組結(jié)果，以GAPDH作為分子內(nèi)標(biāo)，采用2-ΔΔCt法比較分析各組lncRNA55的表達(dá)。

1.2.5Western blot法檢測(cè)c-Myc蛋白的表達(dá) 細(xì)胞裂解液裂解轉(zhuǎn)染后的SCC3細(xì)胞(轉(zhuǎn)染plko.1-shc-Myc、flag-c-Myc及各自對(duì)照組)，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，定量，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。將分離出的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，c-Myc兔單克隆抗體(CST9402，1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，相應(yīng)二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光、顯色，以Actin作為內(nèi)參，分析c-Myc的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6MTT法檢測(cè)SCC3細(xì)胞生長(zhǎng) 將轉(zhuǎn)染shlncRNA55、shlncRNA55-ctrl后的SCC3細(xì)胞按2×103個(gè)/孔密度接種于96孔板，37 ℃分別培養(yǎng)6、12、24、48、72 h，每孔依次加入MTT 20 μl(5 mg/ml)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。在每孔加入DMSO 150 μl，低速振蕩10 min，在酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)量各孔的吸光值(OD)。

1.2.7集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SCC3細(xì)胞增殖 取shlncRNA55和shlncRNA55-ctrl對(duì)照組SCC3細(xì)胞分別接種于6孔板，300個(gè)/孔，每孔加入培養(yǎng)液2 ml，培養(yǎng)10 d，4%多聚甲醛固定15 min，1%結(jié)晶紫染色4 h，清洗晾干后，觀察并拍照。

1.2.8免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA55在SCC3細(xì)胞內(nèi)的定位 將制備好的細(xì)胞標(biāo)本置于含10%固定液的PBS中預(yù)變性5 min，取出標(biāo)本浸在固定液中10 min，2次，立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、90%和100%冰乙醇，每次5 min，標(biāo)本固定后干燥。將50%甲酰胺50 ml倒于濕盒中，37 ℃預(yù)熱。將固定好的細(xì)胞玻片上孵育RNA探針，置于80 ℃的燙板變性10 min，將樣本置于之前的濕盒中，37 ℃雜交過夜。次日，洗脫標(biāo)本，加適當(dāng)濃度TBST溶解的Hoechst染細(xì)胞核1 min，再次洗滌標(biāo)本，封片。熒光顯微鏡下觀察拍照l(shuí)ncRNA55的細(xì)胞內(nèi)定位。

2 結(jié)果

2.1目標(biāo)lncRNA的發(fā)現(xiàn)前期利用高通量測(cè)序技術(shù)在c-Myc tet off的H1299細(xì)胞中(在該系統(tǒng)中加入Doxycycline后c-Myc會(huì)下調(diào))進(jìn)行篩選，送公司檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一些表達(dá)差異顯著的lncRNA。從中選擇了一個(gè)高表達(dá)且變化量約13倍的新lncRNA，認(rèn)為其表達(dá)差異有意義，命名為lncRNA55。由于該系統(tǒng)中c-Myc下調(diào)，而在此結(jié)果中檢測(cè)到lncRNA55表達(dá)上調(diào)，猜測(cè)lncRNA55受c-Myc負(fù)性調(diào)節(jié)，lncRNA檢測(cè)數(shù)據(jù)見表1。

表1 LncRNA55基本數(shù)據(jù)

2.2敲低c-Myc對(duì)SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA55表達(dá)的影響將shc-Myc轉(zhuǎn)染至SCC3細(xì)胞，Western blot檢測(cè)c-Myc蛋白表達(dá)，與轉(zhuǎn)染shc-Myc-ctrl對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)c-Myc表達(dá)降低，證實(shí)成功敲低c-Myc表達(dá),見圖1A。qRT-PCR檢測(cè)c-Myc敲低后的SCC3細(xì)胞內(nèi)lncRNA55表達(dá)量，顯示lncRNA55水平顯著高于對(duì)照組(F=1 358.34，P<0.05)，見圖1B。

圖1 shc-Myc對(duì)SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA55表達(dá)的影響

A:兩組c-Myc蛋白的表達(dá)情況；B:兩組lncRNA55的表達(dá)情況；1：轉(zhuǎn)染shc-Myc-ctrl組；2:轉(zhuǎn)染shc-Myc組；與shc-Myc-ctrl對(duì)照組比較：*P<0.05

2.3過表達(dá)c-Myc對(duì)SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA55表達(dá)的影響將flag-c-Myc轉(zhuǎn)染至SCC3，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示c-Myc蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染flag空載組增高，證實(shí)c-Myc在SCC3內(nèi)成功過表達(dá)，見圖2A。qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)c-Myc的SCC3細(xì)胞內(nèi)lncRNA55表達(dá)量，顯示lncRNA55水平明顯低于flag空載組(F=254.82，P<0.05)，見圖2B。

2.4shlncRNA55干擾lncRNA55表達(dá)的效果將shlncRNA55轉(zhuǎn)染SCC3細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染shlncRNA55組lncRNA55水平顯著低于轉(zhuǎn)染shlncRNA55-ctrl組(F=311.29，P<0.05)，表明shlncRNA55成功下調(diào)了lncRNA55的表達(dá)，見圖3。

2.5lncRNA55對(duì)SCC3細(xì)胞生長(zhǎng)、集落形成能力的影響MTT法、集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染shlncRNA55后SCC3細(xì)胞的生長(zhǎng)和集落形成能力。結(jié)果表明，與shlncRNA55-ctrl組相比，shlncRNA55組轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯增加[(14.78±0.37)vs(19.62±0.30)，F(xiàn)=531.00，P<0.05]，見圖4，細(xì)胞形成的集落數(shù)量增多[(81±5.57)vs(151±4.58)，F(xiàn)=240.98，P<0.05]，見圖5。因此，可以看出敲低SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA55顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖2 flag-c-Myc對(duì)SCC3細(xì)胞中l(wèi)ncRNA55表達(dá)的影響

A:兩組c-Myc蛋白的表達(dá)情況；B:兩組lncRNA55的表達(dá)情況；1：轉(zhuǎn)染flag空載體組:2:轉(zhuǎn)染flag-c-Myc組；與flag空載體組比較：*P<0.05

圖3 shlncRNA55轉(zhuǎn)染后lncRNA55表達(dá)量變化

1：轉(zhuǎn)染shlncRNA55-ctrl組；2：轉(zhuǎn)染shlncRNA55組；與shlncRNA55-ctrl組比較：*P<0.05

2.6lncRNA55的細(xì)胞內(nèi)定位熒光顯微鏡下，lncRNA55呈現(xiàn)紅色熒光，Hoechst染細(xì)胞核為藍(lán)色，合并圖像后可以看出lncRNA55定位在SCC3細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，見圖6，說明lncRNA55可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

圖4 shlncRNA55干擾后SCC3細(xì)胞生長(zhǎng)情況

圖5 結(jié)晶紫染色觀察shlncRNA55干擾后SCC3細(xì)胞集落形成情況

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是一種復(fù)雜的腫瘤性疾病，可發(fā)生在口腔多個(gè)部位，其中以舌鱗狀細(xì)胞癌最常見[7]，因其惡性程度高、預(yù)后差成為臨床治療的難題。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)發(fā)展，基因治療備受關(guān)注，探究舌鱗癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，尋求調(diào)控癌細(xì)胞生長(zhǎng)的靶基因，這將為腫瘤治療提供新策略。

MYC是腫瘤發(fā)生過程中重要的調(diào)控基因，MYC家族包括3個(gè)成員：c-Myc、N-Myc(MYCN)、L-Myc(MYCL)。其中c-Myc是重要的癌基因，正常人細(xì)胞中c-Myc相對(duì)低表達(dá)，而癌細(xì)胞中c-Myc水平明顯升高，研究指出至少一半腫瘤患者體內(nèi)c-Myc活化，同時(shí)，大量體內(nèi)外試驗(yàn)表明c-Myc促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)。目前在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)c-Myc和lncRNA之間存在密切聯(lián)系，并證實(shí)lncRNA-c-Myc網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的激活、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，c-Myc可以調(diào)控一些lncRNA的表達(dá)，而lncRNA也能結(jié)合c-Myc抑制其表達(dá)，二者相互作用共同影響了腫瘤的進(jìn)展[8-9]。

圖6 lncRNA55在細(xì)胞內(nèi)的定位 Hoechst染色×160

研究已經(jīng)在腫瘤中發(fā)現(xiàn)一部分受c-Myc調(diào)控的lncRNA，并證實(shí)這部分lncRNA可能在c-Myc誘導(dǎo)調(diào)控的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。研究[10]顯示在非小細(xì)胞型肺癌中l(wèi)ncRNA H19受c-Myc誘導(dǎo)，c-Myc能上調(diào)H19表達(dá)，進(jìn)而H19下調(diào)miR-107來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。Zhang et al[11]也驗(yàn)證了H19是c-Myc的下游靶基因，通過影響肺癌細(xì)胞凋亡在癌發(fā)展過程中發(fā)揮重要功能，敲低H19能在一定程度上逆轉(zhuǎn)c-Myc誘導(dǎo)的促癌細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)。有關(guān)結(jié)腸癌的研究[12]證實(shí)lncRNA MYU也是c-Myc的直接靶基因，位于Wnt/c-Myc信號(hào)通路下游，在結(jié)腸癌中高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA MYU通過與RNA結(jié)合蛋白hnRNP-K結(jié)合以增強(qiáng)CDK6表達(dá)，來促進(jìn)癌細(xì)胞周期和癌發(fā)展。在肝癌中發(fā)現(xiàn)c-Myc可以直接結(jié)合lncRNA CCAT1啟動(dòng)子部位，通過促進(jìn)對(duì)lncRNA CCAT1上游的調(diào)控來上調(diào)其表達(dá)，表明c-Myc/CCAT1通路參與了肝癌的發(fā)展[13]。盡管關(guān)于c-Myc、lncRNA和腫瘤三者之間關(guān)系的研究已經(jīng)取得了初步進(jìn)展，但目前在舌鱗癌中相關(guān)研究較少。本研究前期應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)篩選因c-Myc下調(diào)誘導(dǎo)引起差異表達(dá)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能受c-Myc負(fù)調(diào)控的lncRNA55，作為研究對(duì)象進(jìn)行驗(yàn)證，并探究了lncRNA55對(duì)舌鱗癌細(xì)胞SCC3增殖的影響。

為了求證舌鱗癌中l(wèi)ncRNA55與c-Myc表達(dá)之間的相關(guān)性，通過基因轉(zhuǎn)染的方法將載體plko.1-shc-Myc轉(zhuǎn)至舌鱗癌細(xì)胞SCC3中，與對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)c-Myc蛋白水平降低，說明成功敲低了c-Myc表達(dá)，同時(shí)顯示lncRNA55的表達(dá)量顯著升高。為了增加結(jié)果的可信度，在SCC3細(xì)胞中過表達(dá)c-Myc，檢測(cè)到c-Myc上調(diào)使lncRNA55表達(dá)減少，結(jié)論與上述一致。這些結(jié)果表明在舌鱗癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA55與c-Myc表達(dá)之間存在負(fù)性相關(guān)，推測(cè)lncRNA55可能受c-Myc負(fù)調(diào)控。接下來為進(jìn)一步評(píng)估lncRNA55在舌鱗癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，在體外構(gòu)建表達(dá)載體plko.1-shlncRNA55，轉(zhuǎn)染至SCC3細(xì)胞，以敲低lncRNA55的表達(dá)。分別通過MTT法、集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SCC3細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果均顯示lncRNA55表達(dá)下調(diào)能顯著促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的增殖，說明lncRNA55可能通過影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)來參與對(duì)腫瘤的調(diào)控。此外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以看出lncRNA55定位在SCC3細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，推測(cè)lncRNA55在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

綜上所述，在舌鱗癌細(xì)胞SCC3中l(wèi)ncRNA55可能受c-Myc負(fù)調(diào)控，敲低lncRNA55的表達(dá)能促進(jìn)SCC3細(xì)胞增殖和集落形成，并證實(shí)lncRNA55在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能。然而，該實(shí)驗(yàn)研究尚淺，lncRNA55對(duì)癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)方式如何，c-Myc-lncRNA55通路如何從基因水平介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)仍不清楚。進(jìn)一步深入探究lncRNA55在舌鱗癌中的作用機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)lncRNA55表達(dá)的有效調(diào)控，將為舌鱗癌分子治療提供新的方向和理論依據(jù)。