徐 婷，王 聰，羅慶禮，沈繼龍

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種全球廣泛傳播的機會致病性原蟲，人類感染弓形蟲主要通過經(jīng)口食入未煮熟的含包囊(cyst)的動物肉類，食入被貓糞中的卵囊(oocyst)污染食物或飲水，以及母嬰先天性垂直傳播三個途徑[1]。近年來研究表明，世界各地分離的弓形蟲株基因型具有豐富的遺傳多態(tài)性和地域差異[2]，流行于我國的弓形蟲株優(yōu)勢基因型為Chinese 1型(即ToxoDB#9型)[3]，且種群內(nèi)存在有2個毒力不同的蟲株：TgCtwh3(以下簡稱Wh3)和TgCtwh6(以下簡稱Wh6)。該文通過對Wh3和Wh6蟲株的毒力研究，比較ROPs家族毒力相關(guān)分子ROP5和ROP18的基因序列差異，為深入探討我國優(yōu)勢基因型弓形蟲株的毒力效應分子多態(tài)性與蟲株致病性的關(guān)系具有重要理論和實際意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物和參考蟲株 5～6周齡雌性SPF級BALB/c小鼠40只，4～6周齡昆明鼠60只，均購自安徽省實驗動物中心，室溫下標準飼養(yǎng)。弓形蟲蟲株Wh3型、Wh6型、RH株(ToxoDB#10型，傳統(tǒng)的Ⅰ型蟲株)和PRU株(ToxoDB#1型，傳統(tǒng)的Ⅱ型蟲株)由安徽省人獸共患病重點實驗室保種傳代。

1.1.2主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒及PCR預混液購自生工生物工程(上海)有限公司；瓊脂糖為西班牙GENE公司產(chǎn)品；PCR純化試劑盒購自美國Axygen公司；基因擴增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。溫度梯度基因擴增儀、電泳儀和電泳槽均為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.1.3引物 根據(jù)通用的弓形蟲ME49蟲株GenBank中ROP5基因(GenBank：XM 002371884.2)和ROP18基因(GenBank：XM 002367716.1)序列，設計PCR擴增引物，分別擴增2個基因的全長序列。引物序列見表1，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 ROP5和ROP18基因全長引物序列

1.2方法

1.2.1弓形蟲株Wh3和RH株的速殖子的獲取 從液氮中取出保種的弓形蟲Wh3和RH株速殖子，腹腔注射接種于4～6周昆明鼠下腹部，接種后密切觀察小鼠進食水及精神狀態(tài)，當小鼠出現(xiàn)發(fā)病癥狀后，麻醉斷頸處死小鼠，抽取腹水并按照本實驗室的常規(guī)方法[4]，PBS洗滌3次后經(jīng)梯度離心法純化并收集速殖子，立即進行后續(xù)的毒力實驗，并-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2弓形蟲株Wh6和PRU株的速殖子的獲取 實驗室弓形蟲Wh6和PRU蟲株保種于慢性感染的昆明鼠，在腦組織中形成包囊。麻醉斷頸處死保種小鼠，取鼠腦加無菌PBS勻漿，離心取勻漿沉淀收集包囊并計數(shù)，腹腔接種昆明鼠包囊200個/只，待小鼠急性感染發(fā)病時，麻醉處死小鼠，收集腹水，同樣純化并收集Wh6和PRU蟲株的速殖子，獲取的速殖子立即進行后續(xù)的毒力實驗，并-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3蟲株RNA提取與總cDNA制備 分別取上述方法收集的速殖子，PBS重懸洗滌，加入1 ml TRIzol，冰上反復吹打裂解常規(guī)方法提取總RNA，按Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，制備cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4蟲株的毒力檢測 將上述收集純化后速殖子經(jīng)PBS稀釋至2 ml置顯微鏡下計數(shù)，按1×103個/只分別腹腔感染SPF級BALB/c小鼠和昆明鼠，每個蟲株各感染10只。逐日觀察各組小鼠的狀態(tài)并計算死亡率和存活時間；若實驗小鼠長期存活，則至感染后45 d，麻醉頸椎脫臼處死各組存活小鼠，腦組織壓片觀察包囊是否形成。累積死亡率(%)=死亡小鼠個數(shù)/感染小鼠個數(shù)×100%。

1.2.5毒力相關(guān)和成囊相關(guān)基因分析 以上述4個蟲株制備的cDNA為模版，分別擴增ROP5和ROP18基因全長。PCR反應體系：弓形蟲cDNA模板2.0 μl，2×PCR Taq預混液25.0 μl，上游引物(10 μmol/L)1.0 μl，下游引物(10 μmol/L)1.0 μl，無核酶水補至總體系50.0 μl。ROP5擴增條件：94 ℃預變性5 min，接著94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；ROP18退火溫度為60 ℃，其余條件同ROP5。PCR結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠觀察反應結(jié)果。擴增產(chǎn)物純化后，送生工生物工程(上海)有限公司進行測序，將測序結(jié)果分別由核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，使用Clustal X軟件進行序列比對分析，分別比較2個毒力因子氨基酸序列在4個蟲株中的差異。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。根據(jù)BALB/c小鼠和昆明鼠感染不同弓形蟲株的存活時間、死亡率，采用χ2檢驗比較小鼠感染各蟲株反應有無差異；不同蟲株兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1蟲株毒力分別取4個蟲株1×103個速殖子經(jīng)腹腔接種BALB/c小鼠后，第5天開始，感染W(wǎng)H3和RH株的BALB/c小鼠出現(xiàn)豎毛、腹水、抽搐等明顯癥狀，至第7天完全死亡；昆明小鼠腹腔接種同樣數(shù)量WH3和RH株弓形蟲速殖子后，存活時間略長于BALB/c小鼠，但在12 d之內(nèi)亦全部死亡。感染后小鼠生存曲線如圖1所示，在感染同一品系小鼠后，兩蟲株之間的毒力差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.4303、1.511，P>0.05)。而同一蟲株感染兩個品系小鼠時，昆明小鼠存活時間明顯長于BALB/c小鼠(P<0.01)，表現(xiàn)出同一蟲株對不同品系的小鼠有著不同的毒力,見表2。而分別感染W(wǎng)H6和PRU蟲株的BALB/c小鼠和昆明小鼠均全部存活至45 d，在這些長期存活的BALB/c小鼠和昆明小鼠腦內(nèi)，均檢出WH6和PRU蟲株的包囊。

2.2毒力相關(guān)和成囊相關(guān)基因擴增結(jié)果通過PCR擴增4株弓形蟲棒狀體蛋白家族的毒力和成囊相關(guān)分子ROP5和ROP18，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：4株弓形蟲ROP5基因分別擴增出略小于2 000 bp的目的片段，與預期的1 650 bp大小一致；ROP18基因分別擴增出略小于2 000 bp的目的片段，與預期的1 665 bp大小一致。見圖2。

2.3基因比對結(jié)果分析上述4株弓形蟲ROP5和ROP18基因擴增產(chǎn)物測序結(jié)果，分別轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后的序列比對分析。圖3所示，4株弓形蟲ROP5和ROP18氨基酸序列進化樹，ROP5氨基酸序列上，WH3株和Wh6株親緣關(guān)系更近，而ROP18氨基酸序列上，WH3株和RH株親緣關(guān)系更近。序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WH3株的ROP5氨基酸序列與RH株和PRU株的一致性(identity)分別為96.2%(528/549)和96.7%(531/549)，ROP18分別為95.8%(531/554)和99.1%(549/554)；WH6株ROP5氨基酸序列與RH株和PRU株的一致性分別為97.8%(542/554)和98.2%(544/554)，ROP18分別為95.8%(531/554)和99.1%(549/554)。WH3株和WH6株在ROP5和ROP18氨基酸序列上，均與PRU株更為接近，與RH株差異較多。

3 討論

傳統(tǒng)生物學的分類標準中弓形蟲屬下僅包含一個種Toxoplasmagondii。目前世界各地從動物體和人體分離的弓形蟲株逐漸增多，通過對這些蟲株的生物學性狀研究表明，各分離蟲株的生活史完全相同，蟲體在各個生活史階段(包括速殖子、包囊、卵囊等)的形態(tài)特征也完全相同。各弓形蟲株唯一的區(qū)別是毒力上的差異，表現(xiàn)為弓形蟲感染小鼠的致死率各不相同。是何種原因所致這種現(xiàn)象，一直是國內(nèi)外學者近年來研究的熱點。

表2 BALB/c小鼠和昆明小鼠分別感染4種弓形蟲株后的存活時間比較

圖1 BALB/c小鼠和昆明小鼠分別感染弓形蟲WH3和RH株后的生存曲線

圖2 瓊脂糖凝膠電泳分析ROP5和ROP18基因PCR產(chǎn)物

A：PCR擴增ROP5基因片段；B：PCR擴增ROP 18基因片段；M：DNA Marker；1：WH3株；2：WH6株；3：RH株；4：PRU株

圖3 4株弓形蟲ROP5和ROP18氨基酸序列進化樹

歐美國家的學者按照蟲株的毒力不同，將弓形蟲簡單劃分Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，各包含著多個蟲株，且感染小鼠分別為“強毒”、“弱毒”和“無毒”。隨著多位點PCR-RFLP技術(shù)的應用，選用10個分型的遺傳標志，將這些蟲株分成了更為詳細的基因型，建立了弓形蟲基因型數(shù)據(jù)庫(ToxoDB)。傳統(tǒng)的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分別為ToxoDB#10型、ToxoDB#1型和ToxoDB#2型。隨著弓形蟲基因型研究的深入，發(fā)現(xiàn)世界各地弓形蟲株具有豐富的遺傳多態(tài)性[2]。而國內(nèi)其他學者以及本實驗室的研究均顯示，流行于中國的弓形蟲株以Chinese 1型(ToxoDB#9)為其優(yōu)勢基因型，具有有限的遺傳多態(tài)性[5-6]。同時本實驗室通過RFLP分型和微衛(wèi)星分型均顯示，Chinese 1基因型蟲株中存在2個分離株WH3和WH6，其毒力和致病性有著明顯的差異[3-4,6]。這種差異也對傳統(tǒng)的觀點提出了挑戰(zhàn)，是何種因素導致這種差異在同一種基因型弓形蟲株中存在，一直是我們重點關(guān)注和深入研究的關(guān)鍵問題。

近年來一系列的研究[7]表明，不同基因型弓形蟲株入侵宿主細胞的過程以及對感染小鼠的毒力存在顯著差異，弓形蟲入侵宿主細胞過程中及定居在宿主細胞內(nèi)，所分泌的包括ROPs、GRAs、MICs、RONs等多種效應分子蛋白，是這些差異產(chǎn)生的主要原因。ROPs效應分子蛋白是由弓形蟲棒狀體(rhoptry)細胞器分泌，在蟲體感染宿主細胞以及誘導宿主免疫應答，甚至感染結(jié)局等方面起到關(guān)鍵的作用。ROPs具有多態(tài)性[8-9]，其中ROP5、ROP16和ROP18等弓形蟲效應蛋白分子研究較多。本實驗室利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除弓形蟲RH株ROP16后發(fā)現(xiàn)，蟲株毒力無明顯變化，提示ROP16在弓形蟲毒力方面非核心分子[10]。

ROP5和ROP18均為ROP2家族的成員[11]。既往的研究可知，ROP5作為ROP18必備的輔助因子，通過強化免疫相關(guān)GTP 酶(immunity-related GTPases，IRGs)的非活化表型來阻止IRGs與GTP結(jié)合[12-13]。ROP18是蟲株多態(tài)性絲/蘇氨酸激酶，ROP18遺傳序列差異決定了其毒力的差異，Ⅰ型蟲株ROP18可使所有品系的小鼠均致死，而Ⅱ型和Ⅲ型比較弱[14]，將Ⅰ型蟲株的ROP18轉(zhuǎn)基因至Ⅲ型蟲株，則出現(xiàn)毒力增強，證實ROP18是弓形蟲株毒力的主要決定因素之一[15]。那流行我國的優(yōu)勢基因型Chinese 1型(ToxoDB#9)弓形蟲的兩個蟲株為何具有不同的毒力和致病性，其ROP5和ROP18有何差異，是本次研究的重點內(nèi)容。

本次的研究顯示，WH3蟲株的ROP5基因型和ROP18基因型與毒力較弱的II型蟲株差異較小，而與毒力較強的I型蟲株差異較大，表明我國流行的優(yōu)勢基因型弓形蟲株的毒力相關(guān)分子與傳統(tǒng)基因型存在差異，也說明若僅僅以一種或少數(shù)幾種毒力分子的遺傳序列來判斷弓形蟲株的毒力具有明顯欠缺之處。