胡 磊，朱耀東，李 平，張 梅

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是一種胃癌前病變，研究證明胃癌前病變患者有著10倍的患癌風(fēng)險(xiǎn)[1]。CAG是胃癌發(fā)病模式Correa 級聯(lián)反應(yīng)中較常見病理階段[2]。目前臨床常用防治萎縮性胃炎的措施有質(zhì)子泵抑制劑、胃黏膜保護(hù)劑及幽門螺桿菌根治、內(nèi)鏡手術(shù)等手段[3]。近年中醫(yī)藥被廣泛用于防治CAG[4]，為胃癌前病變治療拓展了治療思路。亮菌是我國最初發(fā)現(xiàn)并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的一種真菌。中醫(yī)認(rèn)為，該菌對胃腸道有保健功能[5]。目前經(jīng)亮菌發(fā)酵提取的亮菌口服液(Armillariella oral solution, AOS)被臨床常用于慢性肝炎、遷延性肝炎、慢性膽管炎和膽囊炎以及慢性胃炎的治療。對AOS前期研究[6-8]顯示，AOS對返流液誘發(fā)胃黏膜損傷以及化療引起胃腸道副反應(yīng)有著改善作用，其機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶(SOD)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)以及5-羥色胺(5-HT)的活性改變胃腸活動節(jié)律。但對治療CAG的作用機(jī)制，尚未完全清楚。

程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death 4, PDCD4)是一種抑癌基因，研究[9]表明該基因通過在胃癌黏膜組織中表達(dá)下調(diào)及缺失，促進(jìn)腫瘤增殖。同時(shí)既往研究[10]也表明胃癌前病變組織中較正常胃黏膜也存在PDCD4低表達(dá)，PDCD4可作為評估胃癌前病變及其轉(zhuǎn)歸的特異性指標(biāo)。本研究擬制備CAG大鼠模型，觀測AOS對CAG大鼠胃黏膜腺體萎縮及PDCD4表達(dá)的影響，初步探討治療CAG的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑SD雄性大鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，Sprague-Dawley)，SPF級，體質(zhì)量140～180 g，5周齡，共40只。處于室溫24 ℃，濕度50%，通風(fēng)良好環(huán)境中。AOS(合肥誠志生物制藥有限公司，批號為20161109)；胃復(fù)春片(杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為16066146)，稱取藥物溶于蒸餾水配成0.06 g/ml溶液。胃蛋白酶測試盒(南京建成生物工程研究所，批號為20170503)；兔抗大鼠PDCD4多克隆抗體(美國Proteintech公司，批號12587-1-AP)； N-甲基-N硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號為Q94510)；小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng)(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，批號17G37D07)；10%水合氯醛(安徽省立醫(yī)院，批號20170706)。

1.2儀器DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；GFL1008型水浴鍋(深圳市朗誠科技股份有限公司)；SPX-250-2型生化培養(yǎng)箱(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；Thermo Muitioken MK3型酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；5424R型高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司)；BX53型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RM2235型切片機(jī)(德國萊克公司)。

1.3方法所有SD鼠隨機(jī)分為對照組10只，模型制備組30只；對照組自由飲食水，模型制備組自由飲用100 μg/ml MNNG聯(lián)合饑飽失常(飽食2 d，饑餓1 d)9周[11]；隨機(jī)從兩組各取2只SD鼠頸椎脫臼法處死，通過肉眼及HE染色鏡下觀察模型制備情況。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：肉眼可見胃黏膜缺損，黏膜層變薄，胃黏膜由正常的橘紅色變?yōu)榧t白相間，黏膜下血管透見；鏡下觀可見胃黏膜腺體數(shù)目減少，細(xì)胞核固縮且深染，腸上皮化生出現(xiàn)。模型制備過程中2只SD鼠死亡, 從制備組剩余26只鼠中隨機(jī)取25只，依次分為模型組、AOS低劑量組、中劑量組、高劑量組、胃復(fù)春組，每組各5只。從對照組8只鼠中隨機(jī)取5只為正常組。其中正常組及模型組用生理鹽水灌胃，劑量為10 ml/kg；AOS低劑量組、中劑量組、高劑量組用亮菌口服液灌胃，劑量依次為0.5、1.0、2.0 ml/kg ；胃復(fù)春組用胃復(fù)春灌胃，劑量為10.0 ml/kg。干預(yù)期間以上6組正常飲食水，每天灌胃1次，療程28 d。

1.4檢測

1.4.1大鼠一般情況觀察 觀察大鼠情緒、毛發(fā)顏色及外觀、飲食、體質(zhì)量及眼睛的變化，觀察大鼠刺激后的反應(yīng)能力，呼吸的頻率、節(jié)律，大便是否帶血、黏液等。

1.4.2胃液pH、分泌量及胃蛋白酶效價(jià)測定[12]灌藥28 d后，10%水合氯醛 (0.03 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取頭高腳低仰臥位幽門部下端約5 mm處結(jié)扎。靜置4 h，收集胃液。胃液于4 000 r/min離心15 min， 吸上清液于2.0 ml EP管，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液。計(jì)胃液總量并用精密pH試紙測胃液pH值，依據(jù)ELISA試劑盒步驟測胃蛋白酶效價(jià)。

1.4.3胃組織形態(tài)肉眼及鏡下觀察 取胃液后，距賁門部5 mm處切斷，從整個(gè)胃部取部分胃體，沿胃小彎切開，緩慢沖洗干凈，肉眼觀察胃體形態(tài)后，4%中性福爾馬林浸沒2 d后剪取約15 mm×8 mm長條狀組織。胃組織常規(guī)HE染色鏡下觀察胃病理結(jié)構(gòu)。

1.4.4免疫組化測PDCD4蛋白表達(dá) 按照免疫組化SP法，依次脫蠟脫水，檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)抗原修復(fù)，過氧化物酶阻斷劑溫育10 min，洗滌，PDCD4兔抗大鼠多克隆一抗(1 ∶300)，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗，DAB顯色4 min，復(fù)染細(xì)胞核，脫水、封片。結(jié)果判斷以光鏡下觀察視野中呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，視野中染色程度分級：無染色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。每張載玻切片隨機(jī)選取6個(gè)視野光鏡觀察，以陽性細(xì)胞占視野比例分級：無陽性細(xì)胞0分，<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分。計(jì)視野染色程度分級及陽性細(xì)胞占視野比例分級數(shù)值的乘積為總分進(jìn)行分析比較(總分=PDCD4表達(dá)陽性細(xì)胞比例分級×染色程度)。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況對照組大鼠情緒穩(wěn)定，刺激后反應(yīng)靈敏，動作靈活，呼吸規(guī)律，毛發(fā)細(xì)膩光澤，眼睛紅潤，大便正常。模型制備早期大鼠躁動與淡漠情緒交替，刺激后反應(yīng)遲鈍，呼吸稍急促，毛發(fā)暗黃粗糙，眼睛黯淡，活動少，食少；模型制備后期大鼠情緒淡漠，幾乎不活動，常蜷曲伴顫抖，乍毛，大便灰褐色稀稠樣。經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組與胃復(fù)春組明顯好轉(zhuǎn)；較正常組毛發(fā)顏色稍有差異，其他無明顯差異。但AOS低劑量組大鼠反應(yīng)仍遲鈍，活動及食量介入正常組與模型組之間，呼吸稍急促。藥物干預(yù)期間未發(fā)生大鼠死亡。各組體質(zhì)量變化見表1。

表1 治療期間各組大鼠體質(zhì)量變化比較

與模型組比較：*P<0.05；與正常組比較：##P<0.01

2.2胃液pH、分泌量及胃蛋白酶效價(jià)各組結(jié)果比較28 d后，與正常組比較，模型組大鼠胃液pH值升高(P<0.01)，胃液分泌量及胃蛋白酶效價(jià)明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組及胃復(fù)春組胃液pH值降低(P<0.01)，胃液分泌量增加及胃蛋白酶效價(jià)增多(P<0.05)。見表2。

2.3病理形態(tài)變化

2.3.1肉眼觀察 正常組胃黏膜層表面完整、光滑、無出血點(diǎn)，呈肉紅色；皺襞完整凸起、無序交錯(cuò)、厚薄均一、皺襞表面有適量透明黏液。與正常組比較，模型組黏膜層表面粗糙呈細(xì)顆粒狀、少量出血點(diǎn)，色澤紅白相間；皺襞明顯變淺、皺襞間交錯(cuò)不連續(xù)、厚薄不均一；部分皺襞變淺，甚至消失；黏膜層厚度薄、表面黏液量少、黏膜下血管透見。與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組及胃復(fù)春組胃表面較完整、出血點(diǎn)極少、色澤淡紅色；皺襞多見，其表面有大量黏液附著。AOS低劑量組胃黏膜層厚薄不均一；黏膜表面仍有粗糙且少許出血點(diǎn)，局部色澤紅白相間。見圖1。

2.3.2鏡下觀察 正常組胃體部腺體排列整齊、 腺體大小一致；黏膜層厚度及胃小凹深度適中；固有層偶見少量炎性細(xì)胞；細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞核正常，核漿比正常。模型組胃腺體縮小且腺管排列紊亂扭曲，腺體減少；黏膜層變薄且腸上皮化生，胃小凹變淺；黏膜層及固有層有大量炎性細(xì)胞、散在分布；細(xì)胞核深染固縮，核漿比例失調(diào)。與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組及胃復(fù)春組腺體排列及大小明顯改善，細(xì)胞核漿比基本正常；腸型腺上皮與炎性細(xì)胞減少。但AOS低劑量組改善不明顯，腺管排列仍紊亂，細(xì)胞核漿比有異常。見圖2。

2.4免疫組化測胃組織PDCD4蛋白表達(dá)胃組織中有PDCD4蛋白表達(dá)呈棕色，無PDCD4蛋白表達(dá)呈藍(lán)色。與正常組比較，模型組PDCD4表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，AOS中劑量組、高劑量組PDCD4蛋白表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)；同時(shí)AOS高劑量組及胃復(fù)春組表達(dá)多于低劑量組及中劑量組。見表2、圖3。

表2 治療后各組大鼠胃液pH值、分泌量、胃蛋白酶效價(jià)及胃黏膜組織PDCD4表達(dá)比較

與正常組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖1 AOS對大鼠胃黏膜大體形態(tài)的影響A：正常組；B：模型組；C：AOS低劑量組；D：AOS中劑量組；E：AOS高劑量組；F：胃復(fù)春組

圖2 AOS對大鼠胃組織病理變化的影響 HE染色×200A：正常組；B：模型組；C：AOS低劑量組；D：AOS中劑量組；E：AOS高劑量組；F：胃復(fù)春組

圖3 AOS對CAG大鼠PDCD4表達(dá)的影響 免疫組化×400A：正常組；B：模型組；C：AOS低劑量組；D：AOS中劑量組；E：AOS高劑量組；F：胃復(fù)春組

3 討論

慢性萎縮性胃炎作為胃癌前病變的一種，是目前的治療熱點(diǎn)，不斷探索最有效治療手段緩解CAG消化道癥狀及改善生活質(zhì)量。亮菌口服液在臨床上用于慢性萎縮性胃炎患者治療有著顯著的療效，但其長期缺乏基礎(chǔ)研究及作用機(jī)制不明。本研究制備CAG大鼠模型，觀察AOS對胃液pH值、分泌量、胃蛋白酶效價(jià)、胃黏膜腺體萎縮及PDCD4蛋白表達(dá)的影響。CAG胃黏膜病變過程中黏膜腺體萎縮，甚至消失，表面黏液層逐漸減少。正常胃黏膜表面由黏液及碳酸氫鹽形成約0.5 mm凝膠黏液屏障保護(hù)層，具有緩解食物機(jī)械性損傷、細(xì)菌生物損害及H+化學(xué)侵蝕作用。而黏液及碳酸氫鹽由胃黏膜層分泌，其中隨著黏膜萎縮加重，分泌細(xì)胞減少，從而直接影響鹽酸、胃蛋白酶原不同程度的缺乏，進(jìn)一步干擾胃部消化、殺菌、營養(yǎng)等功能。因此，本研究通過胃液pH值、分泌量、胃蛋白酶效價(jià)間接反映AOS治療后CAG大鼠病理轉(zhuǎn)歸，同時(shí)經(jīng)肉眼及鏡下直接觀察AOS可抑制黏膜萎縮。

研究[13]發(fā)現(xiàn)PDCD4在人類胃癌組織存在下調(diào)，萎縮性胃炎黏膜中PDCD4也低表達(dá)。PDCD4基因低表達(dá)可能與miRNA的3′-UTR位點(diǎn)被干擾影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。胃癌組織中miR-208a-3p表現(xiàn)尤為突出，隨著表達(dá)增加PDCD4基因表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)胃組織細(xì)胞增殖加快及細(xì)胞核的特定變化[14-15]。本研究證實(shí)CAG PDCD4基因蛋白表達(dá)少，隨著AOS抑制CAG胃黏膜萎縮后PDCD4基因蛋白表達(dá)增多。因此，CAG的轉(zhuǎn)歸機(jī)制可能與PDCD4基因表達(dá)有關(guān)。通過對PDCD4研究，探討與CAG病情轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，可通過對結(jié)合其他相關(guān)基因多靶點(diǎn)監(jiān)測判斷AOS改善CAG治療療效有著一定臨床意義。也對AOS的深入研究，探討其更多的作用機(jī)制及臨床適應(yīng)癥提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)依據(jù)。