揭 磊，洪汝濤，張玉潔

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝臟對(duì)多種慢性損傷后的共同病理階段，最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[1-2]。目前臨床上尚無很有效治療措施。研究[3]表明，肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSCs)在肝纖維化發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[4]。研究[5]表明，PDGF是最強(qiáng)致炎因子之一，PDGF-BB及其受體在HSCs激活中起到關(guān)鍵作用。自噬是一種代謝過程，可維持細(xì)胞正常功能。研究[6]表明，自噬可激活HSCs，導(dǎo)致肝纖維化。褪黑素是松果體分泌的一種活性物質(zhì)。課題組前期研究[7-9]表明褪黑素對(duì)四氯化碳所致肝纖維化大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路及抑制HSCs的增殖有關(guān)。該課題通過研究HSCs自噬水平及褪黑素干預(yù)，進(jìn)一步探究褪黑素抗纖維化作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及試劑HSCs系(HSC-T6)(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；褪黑素(美國(guó)Sigma公司)；PDGF-BB(美國(guó)PeproTech公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(南京Wisent生物公司)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；MTT(美國(guó)Sigma公司)；抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；抗Beclin1抗體、抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain-3,LC3)抗體(美國(guó)Abcam公司)；抗β-actin 抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；DMSO、PMSF、青霉素/鏈霉素、胰酶消化酶、BCA試劑盒、PVDF膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h換液，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)傳代，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。按實(shí)驗(yàn)需求，將細(xì)胞分為5組，即：模型組及實(shí)驗(yàn)組(3組)加入PDGF-BB(10 ng/ml)[10]，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的褪黑素(1 nmol/L、 1 μmol/L、0.1 mmol/L)。對(duì)照組加入等量PBS。

1.3MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC-T6細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，置于DMEM重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/孔，接種于96孔板內(nèi)，每孔200 μl。分為5組：對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組(褪黑素1 nmol/L、1 μmol/L、0.1 mmol/L組)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，除對(duì)照組外，其余各組均加入PDGF-BB(10 ng/ml)作用30 min，后在實(shí)驗(yàn)組分別加入相應(yīng)濃度的褪黑素，對(duì)照組加入等體積的PBS。藥物作用48 h后棄去上清液，加入MTT(5 mg/ml)作用4 h。后棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO,將96孔培養(yǎng)板置于搖床上震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(optical density，OD)值。

1.4Westernblot實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC-T6細(xì)胞消化后接種于培養(yǎng)瓶，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，除對(duì)照組外，其余各組均加入PDGF-BB(10 ng/ml)作用30 min，在實(shí)驗(yàn)組加對(duì)應(yīng)濃度的褪黑素，對(duì)照組加等體積PBS。作用48 h后提取總蛋白，利用BCA法予以蛋白定量，取10 μl樣品上樣電泳，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h ，用PBS洗5 min×3次，加抗α-SMA、Beclin1、LC3、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-β(platelet derived growth factor receptor-β,PDGFR-β) 一抗(1 ∶2 000)，抗β-actin一抗(1 ∶3 000)，置于4 ℃冰箱過夜，次日室溫孵育30 min后用PBST洗滌 10 min ×3 次，加二抗(1 ∶80 000)，室溫孵育1.5 h后，用PBST洗滌 10 min ×3 次，加ECL顯色液顯影。β-actin 作為內(nèi)參，用IPWIN 6.0軟件分析結(jié)果，蛋白表達(dá)水平以目的蛋白/β-actin的平均灰度比值表示。

2 結(jié)果

2.1褪黑素對(duì)PDGF-BB激活的HSC-T6細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PDGF-BB激活了HSCs，促進(jìn)其增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照組相比，褪黑素可抑制HSCs的增殖。見表1。

表1 褪黑素對(duì)PDGF-BB激活的HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較:**P<0.01;與模型組比較:##P<0.01

2.2褪黑素對(duì)HSC-T6細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，PDGF-BB激活的HSC-T6細(xì)胞α-SMA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.954，P<0.05)；而相對(duì)于模型組，褪黑素可降低HSC-T6細(xì)胞α-SMA的表達(dá)(F=13.954，P<0.05)。見圖1。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：褪黑素1 nmol/L組；D：褪黑素1 μmol/L組;E:褪黑素0.1 mmol/L組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.3褪黑素對(duì)HSC-T6細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，在PDGF-BB激活的HSC-T6細(xì)胞中，Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組明顯增加(F=6.205、48.283，P<0.05)；相對(duì)于模型組，在褪黑素干預(yù)的各治療組中，Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)顯著減低(F=6.205、48.283，P<0.05)。見圖2。

2.4褪黑素對(duì)HSC-T6細(xì)胞PDGFR表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，在PDGF-BB激活的HSC-T6細(xì)胞中，PDGFR表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組顯著增高(F=18.848，P<0.01)；相對(duì)于模型組，褪黑素干預(yù)的HSC-T6細(xì)胞中，PDGFR表達(dá)明顯降低(F=18.848，P<0.05)。見圖3。

3 討論

肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時(shí)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，激活HSCs，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)的病理過程。該過程中，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞被纖維組織所替代，最終發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康。相關(guān)研究[3]表明，肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，經(jīng)適當(dāng)?shù)母深A(yù)，其病理過程可被阻止，甚至逆轉(zhuǎn)。因此，積極開發(fā)安全有效的抗肝纖維化藥物有重要的臨床意義。

圖2 褪黑素對(duì)Beclin1蛋白及LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

A：對(duì)照組；B：模型組；C：褪黑素1 nmol/L組；D：褪黑素1 μmol/L組;E:褪黑素0.1 mmol/L組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

褪黑素具有抗炎抗氧化作用，同時(shí)也有抗纖維化作用。Lebda et al[11]結(jié)果顯示，褪黑素可抑制炎癥介質(zhì)的分泌、對(duì)抗氧化應(yīng)激、抑制纖維化進(jìn)程等，從而起到抗肝纖維化作用。González-Fernández et al[12]研究表明，褪黑素具有抗纖維化作用，可能與抑制鞘氨醇激酶1-1-磷酸鞘氨醇(SphK1-S1P)信號(hào)通路有關(guān)。此外，本課題組前期研究[7-9]表明，褪黑素具有抗纖維化作用，可能與其抗氧化、抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)HSCs，以PDGF-BB激活及褪黑素干預(yù)，通過MTT法及Western blot法檢測(cè)HSCs增殖、激活及其自噬表達(dá)水平，結(jié)果表明，褪黑素可抑制HSCs增殖及激活，可能是通過抑制HSCs內(nèi)自噬水平發(fā)揮作用。

HSCs是一種間質(zhì)細(xì)胞，存在于肝臟狄氏間隙。正常情況下，HSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)；但當(dāng)肝臟受到損傷產(chǎn)生炎癥介質(zhì)時(shí)，如TGF-β、PDGF等，HSCs被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞(myofibroblast cells,MFC),分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促使肝纖維化的發(fā)展。其中，α-SMA是HSCs激活的標(biāo)志。目前，一些研究將抑制HSCs的激活作為抑制肝纖維化的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明褪黑素可能通過抑制HSCs的激活和增殖發(fā)揮抗肝纖維化作用。

圖3 褪黑素對(duì)PDGFR蛋白表達(dá)的影響

A：對(duì)照組；B：模型組；C：褪黑素1 nmol/L組；D：褪黑素1 μmol/L組;E:褪黑素0.1 mmol/L組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

自噬是廣泛存在于人體的一種代謝過程。人體的衰老細(xì)胞器、內(nèi)膜等被自噬體吞噬，轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，維持細(xì)胞新陳代謝。有研究[13]表明，自噬可促進(jìn)HSCs的激活，導(dǎo)致肝纖維化。靜息狀態(tài)下，HSCs中含有大量脂滴及維生素A，為HSCs未被激活的標(biāo)志。而在HSCs被激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的自噬體可吞噬脂滴，轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體進(jìn)行β氧化，為HSCs的活化及其分泌大量膠原蛋白等提供能量。Shen et al[14]試驗(yàn)結(jié)果表明，蝦青素可抑制HSCs的活化，其作用機(jī)制可能與蝦青素抑制HSCs內(nèi)自噬的水平有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素可能通過抑制HSCs內(nèi)自噬水平從而抑制其激活及增殖。

在HSCs激活過程中，PDGF-BB/PDGFR-β信號(hào)通路扮演重要角色。PDGF-BB與其受體PDGFR-β結(jié)合，啟動(dòng)該信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)展。且在慢性肝損傷中，PDGF-BB 和 PDGFR-β的表達(dá)相對(duì)于正常肝組織明顯增加[15]。有研究[10]表明，PDGF-BB能激活HSCs并促進(jìn)其增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素干預(yù)可能通過抑制PDGF-BB/PDGFR-β信號(hào)通路而抑制HSCs激活及增殖。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用PDGF-BB激活HSCs，結(jié)果顯示，PDGF-BB能激活HSCs、促進(jìn)其增殖，該作用可能與PDGF-BB啟動(dòng)PDGF-BB/PDGFR-β信號(hào)通路，上調(diào)HSCs的自噬水平有關(guān)；而褪黑素可抑制HSCs的激活及增殖，其機(jī)制可能與褪黑素抑制PDGF-BB/PDGFR-β信號(hào)通路，進(jìn)而抑制HSCs內(nèi)自噬水平有關(guān)。這為肝纖維化的治療提供新的思路。