任 樂，陳 軍，楊席席，韋瑞玲，許 朝，余 躍

胰腺癌被認為是最致命的惡性腫瘤，5年生存率不足5%[1]。由于其早期癥狀隱匿且不典型，大多數(shù)患者在初次被確診的時候已經(jīng)到了中晚期，失去了手術(shù)治療機會。臨床上大多采用藥物化療(如吉西他濱)、放射治療以及生物治療等方法。但由于副作用多、靶向性差等弱點限制了這些方法的應用。光熱療法(photothermal therapy，PTT)在腫瘤治療領(lǐng)域具有重要的應用價值。金納米粒子(gold nanoparticles，AuNPs)由于其獨特的性質(zhì)被認為可以作為PTT 的理想材料[2]。研究[3]顯示精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)在動物腫瘤實驗中表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向性。也有研究[4]報道富含半胱氨酸(cysteine)的酸性蛋白可增加胰腺癌對吉西他濱化療敏感性。該研究旨在觀察精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(Arg-Gly-Asp-Cys，RGDC)修飾的AuNPs協(xié)同PTT殺傷人原位胰腺癌細胞BxPC-3的效果，為AuNPs體內(nèi)外抗胰腺癌提供新的方法參考。

1 材料與方法

1.1材料氯金酸、檸檬酸鈉購自上海國藥集團化學試劑有限公司；RGDC購自美國MedChemExpress公司；人胰腺癌細胞系BxPC-3細胞購自中科院上海細胞庫；RPMI-1640購自美國Invitrogen公司；噻唑藍(MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司；鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein，AM)和溴乙非啶豪莫二聚體(ethidium homodimer-1)購自美國賽默飛世爾公司 。

1.2方法

1.2.1RGDC肽修飾的AuNPs(RGDC/AuNPs)制備 取50 ml 1 mmol/L的氯金酸在劇烈攪拌(1 000 r/min)條件下煮沸。隨后迅速加入5 ml，38.8 mmol/L的檸檬酸鈉，待顏色由淺黃變成紫紅色，繼續(xù)煮沸10 min，AuNPs制備完畢，冷卻待用。取400 μl的上述AuNPs和400 μl RGDC(1 mmol/L)分散在5 ml的超純水中，置于28 ℃的水浴鍋中過夜，隨后用超純水6 000 r/min離心5 min去除多余的RGDC(重復3次)，RGDC/AuNPs粒子制備完畢。

1.2.2細胞培養(yǎng) 使用RPMI-1640 培養(yǎng)液(含有10% PBS和1%的雙抗)，將BxPC-3細胞置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，貼壁達到80%～90%時，利用0.25%的胰酶消化傳代。

1.2.3電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)檢測RGDC肽修飾前后的金納米粒子被細胞攝取的情況 待BxPC-3細胞孵育至對數(shù)期，用胰酶消化吹打重懸，種24孔板，每孔5×106個放置溫箱培養(yǎng)24 h，用RPMI-1640培養(yǎng)液分別配置AuNPs粒子和RGDC/AuNPs粒子，濃度分別為5、10、20 μg/ml，將不做任何處理的細胞孔作為空白對照，將上述溶液分別加入孔板中，每組設(shè)置3個復孔，在37 ℃溫箱中孵育24 h。之后吸出上清液，棄去含AuNPs 的培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，胰酶消化并計算細胞密度；1 500 r/min離心10 min；超聲裂解細胞，高速離心20 min；吸出上清液，烘干，用王水溶解、超純水定容，用 ICP-MS 測量AuNPs 含量。用測得的AuNPs含量除以總的細胞數(shù)量得到平均細胞攝取量。

1.2.4MTT法檢測光照后各組對細胞的殺傷作用 收集對數(shù)期BxPC-3細胞，置37 ℃、5% CO2溫箱孵育24 h，每孔加入10 μl不同納米粒子組溶液，濃度分別為5、10、20 μg/ml，同時設(shè)置不含納米粒子的對照孔，每組設(shè)定3復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。洗掉孔板中培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液。分別用波長532 nm的光0.5 W/cm2的功率照射各組細胞5 min，在一次照射停止后，直至分散液的溫度恢復到室溫之后再重復照射，累計3次。光照結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入配好的MTT(1 mg/ml)，繼續(xù)溫箱培養(yǎng)4 h，加入20% 十二烷基硫酸鈉裂解液 (sodium dodecyl sulfate，SDS)，高速震蕩10 min，再用酶標儀(570 nm波長)檢測各孔吸光度(optical density，OD)值。以如下公式計算細胞存活率(%)=(實驗組OD值-調(diào)零組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%。

1.2.5活死細胞染色法檢測光照后各組對細胞的殺傷作用 進一步通過活死細胞染色直觀地觀察這種低功率光強下的MTT殺傷胰腺癌細胞的效果，種板方法同MTT檢測，培養(yǎng)24 h后洗凈原有培養(yǎng)液，加入新的完全培養(yǎng)液，實驗分為3組，即不加AuNPs的空白對照組、10 μg/ml AuNPs組和10 μg/ml RGDC/AuNPs組，分別用波長532 nm的近紅外光0.5 W/cm2的功率照射三組細胞5 min，繼續(xù)放入溫箱培養(yǎng)8 h，隨后加入用PBS配置好的活死細胞染色液鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein，AM)2 μm/ml和溴乙非啶豪莫二聚體(ethidium homodimer-1,4 μm/ml)，每孔100 μl，室溫下孵育30 min，熒光顯微鏡拍照保存，最后用Image J統(tǒng)計各張圖片中的死細胞及活細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1納米粒子的成功制備電鏡視野下可觀察到數(shù)個致密的球形形貌，平均粒徑在45 nm左右。見圖1。 RGDC/AuNPs粒子及單純AuNPs粒子的紫外吸收峰值，RGDC/AuNPs粒子和AuNPs粒子吸收曲線存在明顯不同，提示了RGDC/AuNPs粒子制備成功。見圖2。

圖1 透射電鏡檢測AuNPs粒子的顆粒大小及形貌

圖2 RGDC四肽修飾前后AuNPs粒子紫外吸收變化

2.2細胞對RGDC修飾前后的金納米粒子的攝取情況兩組金納米粒子(AuNPs組和RGDC/AuNPs組)分別在2.5、5、10、20 μg/ml的濃度下與BxPC-3細胞孵育24 h，隨后利用ICP-MS檢測細胞對不同濃度條件下兩組納米粒子的攝取含量。隨著濃度梯度的增加，BxPC-3細胞對兩組納米粒子的攝取含量呈增長趨勢。在不同濃度梯度下，RGDC/AuNPs組的攝取量均多于AuNPs組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

2.3光照前后各組對細胞的殺傷作用在未進行光照的情況下，各組中BxPC-3細胞的細胞存活率都

在80%以上，且組間存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3A。進一步采用波長為532 nm，功率密度為0.5 mW/cm2的激光照射兩組細胞5 min，照射停止后，待分散液的溫度恢復到室溫之后再重復照射，累計3次，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后檢測了各組的細胞數(shù)量。在3個不同濃度梯度下，RGDC/AuNPs組對胰腺癌細胞BxPC-3殺傷效果明顯強于AuNPs組(P<0.01)，表明RGDC/AuNPs粒子可能通過光熱協(xié)同效應來抑制胰腺癌細胞BxPC-3，見圖3B、表2。

表1 不同濃度的兩組納米粒子和胰腺癌細胞共同培養(yǎng)后對兩組納米粒子攝取的量的比較

2.4熱療法對各組細胞抑制的情況通過活死細胞染色進一步直觀地觀察光熱療法抑制細胞增長的效果。在活死細胞染色中，活細胞被標記為綠色，死細胞被標記為紅色。選取激光波長為532 nm，功率密度為0.5 W/cm2，經(jīng)過照射后發(fā)現(xiàn)未加入AuNPs的空白對照組基本無紅色標記的死細胞出現(xiàn)，見圖4A；10 μg/ml AuNPs組有少量死細胞，見圖4B；而10 μg/ml RGDC/AuNPs組則從出現(xiàn)大面積的死細胞，見圖4C。計數(shù)結(jié)果顯示RGDC/AuNPs組對細胞的抑制率明顯高于AuNPs組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

表2 光照下各組納米粒子對胰腺癌細胞生長抑制率的影響

表3 活死細胞染色法檢測各組對胰腺癌細胞生長抑制率的影響

與AuNPs組比較：**P<0.01

3 討論

AuNPs具有獨特的表面等離子體共振的特性及光熱轉(zhuǎn)換效率顯著，在PTT抗腫瘤上被越來越多地研究[5]。由于AuNPs通過胞吞作用進入細胞較難，細胞攝取率較低，限制了其臨床應用。如何通過對納米粒子的表面修飾增加對特定腫瘤細胞的靶向性，從而更有效地殺滅腫瘤細胞仍然是一個巨大挑戰(zhàn)。

整合素被認為在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，而RGD序列被認為是絕大多數(shù)整合素的特異性配體，可控制及介導細胞在生物材料上的粘附行為[6]。Han et al[7]研究發(fā)現(xiàn)對RGD肽一級序列后引入新的氨基酸可改變其對不同組織的親和性。前期研究[8]顯示胰腺癌細胞及其周圍的基質(zhì)分泌大量的已知的具有與紫杉醇療效相關(guān)性的蛋白質(zhì)，富含半胱氨酸。并且，該富含半胱氨酸的蛋白是一種分泌性細胞基質(zhì)糖蛋白，是一個潛在的細胞周期抑制因子，在接近70%的胰腺癌患者中存在表達[9]。因此，本實驗從如何對納米粒子表面功能化，開發(fā)出針對性的增強胰腺癌細胞對納米粒子的攝取等方面出發(fā)，制備了RGDC/AuNPs納米粒子。由于通過金巰鍵和AuNPs之間的共價連接形成較強的耦合，納米粒子的表面等離子體共振峰向近紅外區(qū)域移動，從而使這種納米平臺可被有效的用于PTT中[10]。

圖3 MTT法檢測各組粒子光照或非光照對胰腺癌細胞BxPC-3細胞的殺傷作用

A：未光照的兩組粒子對胰腺癌細胞BxPC-3細胞孵育6 h的毒性；B： 光照6 h后兩組粒子對胰腺癌細胞BxPC-3細胞的殺傷作用；與AuNPs組比較：**P<0.01

圖4 活死細胞染色法檢測各組之間光照后對細胞的殺傷效果 ×200

圖5 AuNPs和RGDC/AuNPs在光熱條件下殺傷胰腺癌細胞的效果圖

進一步觀察RGDC/AuNPs較普通AuNPs的優(yōu)勢，ICP-MS定量檢測直接證實了RGDC肽修飾的AuNPs被胰腺癌細胞攝取率顯著提高，接近單純金納米粒子的2倍，其中的原因可能歸結(jié)于RGDC肽對胰腺癌有主動的靶向性。另外，經(jīng)過PTT照射后，RGDC/AuNPs顆粒能夠顯著增加光熱效率，原因可能是經(jīng)光照射后，巰金鍵斷裂，更多的AuNPs和RGDC游離在細胞內(nèi)，提高對細胞的損傷作用[11]。由于金巰鍵通常較為穩(wěn)定，既可以減少納米粒子的非靶向釋放，同時這種化學鍵可與硫醇反應和(或)發(fā)生熱裂[12]。Piao et al[13]通過將金納米籠與細胞膜抗菌肽組成的協(xié)作納米系統(tǒng)作為光熱抗癌劑，在近紅外光照射下，該納米系統(tǒng)所產(chǎn)生的有效光熱殺傷了癌細胞，這可能是由于通過由金納米籠的光熱啟動細胞內(nèi)的硫醇反應使得金巰鍵斷裂進而釋放抗菌肽，進一步起到膜損傷的作用。同時有研究[14]發(fā)現(xiàn)RGDC修飾的二氧化鈦 (titanium dioxide, TiO2)在紫外輻射下對海拉細胞(HeLa)具有更高的殺傷效果。本研究結(jié)果顯示RGDC/AuNPs組對細胞的抑制率明顯高于AuNPs，這可能歸因于RGDC四肽本身對胰腺癌細胞表面整合素的靶向性以及RGDC四肽富含半胱氨酸，其對AuNPs殺傷胰腺癌細胞也具有一定的協(xié)同作用。具體的模擬圖見圖5。

綜上所述， 通過引入帶有巰基的半胱氨酸形成RGDC的四肽，使得半胱氨酸引入的巰基直接通過金巰鍵修飾到RGDC/AuNPs表面，由于這種RGDC四肽修飾后的納米粒子具有對胰腺癌細胞的靶向性，增加了胰腺癌細胞對這種納米粒子的攝取率， 同時實現(xiàn)了RGDC/AuNPs在熱響應性情況下可發(fā)生巰基斷裂從而釋放RGDC四肽，增加了胰腺癌細胞內(nèi)富含半胱氨酸的RGDC四肽的游離濃度，增強胰腺癌細胞對吉西他濱化療敏感性，進一步達到在光熱治療時對胰腺癌細胞的協(xié)同殺傷作用，為AuNPs體外抗胰腺癌提供新的方法參考。但RGDC/AuNPs在體內(nèi)應用效果有待進一步研究。