霍俊偉，劉慶帥，秦 棟，孫小娟，李芳曉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寒地小漿果開發(fā)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，哈爾濱 150030）

抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）是從食物中攝取的小分子物質(zhì)，具有極強(qiáng)抗氧化性，具有防治壞血病，參與造血、促進(jìn)膠原蛋白合成，治療哮喘、抗腫瘤等作用[1-2]。其在植物內(nèi)可清除自由基，作為某些還原酶輔因子參與還原反應(yīng)，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)開花、延緩衰老、促進(jìn)細(xì)胞分裂、碳氮代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞等生理調(diào)控過程具有重要作用[3-4]。L-半乳糖途徑是大多數(shù)植物抗壞血酸生物合成主要途徑[5-6]，已在蘋果[7]、葡萄[8]、刺梨[9]、番茄[10]和獼猴桃[11]等園藝作物上得到驗(yàn)證?？箟难?谷胱甘肽（Ascorbate-glutathione，AsA-GSH）循環(huán)是AsA再生途徑之一，其在黑穗醋栗果實(shí)AsA積累中作用已被證實(shí)[12]。

黑穗醋栗（Ribes nigrum L.）屬虎耳草科（Saxifragaceae）茶藨子屬落葉叢生灌木[13]，果實(shí)為黑色漿果，有光澤，近球形，味酸甜，清香，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含高水平AsA，含量高達(dá)200～400 mg·100 g-1FW[14]，是重要AsA植物源。

黑穗醋栗不同品種果實(shí)AsA含量不同，差異明顯，AsA含量與抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性呈正相關(guān)，果實(shí)AsA含量較高品種，葉片AsA含量也高，果實(shí)坐果后葉片AsA含量明顯下降[15]。

研究表明，植物葉片等源器官具備完整AsA合成途徑，由于AsA長(zhǎng)距離運(yùn)輸理論的提出，使植物庫器官AsA形成機(jī)制復(fù)雜化，尤其對(duì)葡萄、蘋果、梨、越橘等低AsA含量水果的AsA合成能力，其組織間差異是研究果實(shí)AsA積累機(jī)制基礎(chǔ)，也是提高果實(shí)AsA水平前提[16]。14C喂飼擬南芥和紫花苜蓿后，發(fā)現(xiàn)AsA可從葉片經(jīng)韌皮部向芽、花和根長(zhǎng)距離運(yùn)輸[17]；AsA轉(zhuǎn)運(yùn)參與刺梨果實(shí)AsA積累，但刺梨除果實(shí)外，其他各組織器官DHA含量均較高，葉片AsA和DHA濃度相對(duì)其他葉柄和枝條更高，刺梨可能以葉片為合成源頭，將氧化產(chǎn)物長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)[18]。番茄同位素標(biāo)記試驗(yàn)表明，番茄植株AsA從葉片輸出后大部分積累在綠色未成熟果實(shí)中，而在成熟果實(shí)中未積累[19]。可見長(zhǎng)距離運(yùn)輸積累AsA途徑，不僅在器官和組織間存在差異，也因物種不同而不同。

為進(jìn)一步研究黑穗醋栗果實(shí)與葉片AsA含量關(guān)系，Qin等在果實(shí)開始坐果時(shí)，摘去50%果實(shí)（總坐果量50%），探討摘果處理對(duì)AsA含量及AsA-GSH循環(huán)影響，結(jié)果表明，摘果處理顯著增加果實(shí)AsA含量，但葉片AsA含量減少；而摘果處理組枝條果實(shí)AsA含量增加與減少與自身AsA再生循環(huán)無聯(lián)系，可能受枝條總?cè)~片AsA含量影響[12]。葉片減少是否影響果實(shí)AsA含量及AsAGSH代謝循環(huán)，尚未見詳細(xì)報(bào)道。

為全面揭示黑穗醋栗果實(shí)AsA合成積累機(jī)理，本試驗(yàn)作摘葉處理，探討摘葉處理對(duì)葉片和果實(shí)AsA含量及AsA-GSH代謝循環(huán)影響，為選育高含量AsA加工專用新品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材為8年生、長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致但果實(shí)AsA含量差異顯著的3個(gè)栽培品種：亞德、布勞德和利桑佳，其果實(shí)和葉片AsA含量見表1。試材定植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑穗醋栗種質(zhì)資源圃內(nèi)，管理水平中等。

1.2 摘葉處理

黑穗醋栗果實(shí)開始坐果時(shí)（5月初），每個(gè)品種單株選取生長(zhǎng)勢(shì)相近、結(jié)果數(shù)及葉片數(shù)相近兩個(gè)植株，對(duì)其中1個(gè)植株摘葉處理，去除其50%葉片，另一植株作對(duì)照，每個(gè)品種處理30個(gè)單株，每次采樣后保證處理枝條葉片始終是對(duì)照枝條總?cè)~片數(shù)50%。每隔7 d采樣1次，直至果實(shí)成熟，共采樣8次。每次取樣后，當(dāng)天或第2天測(cè)量部分新鮮果實(shí)和葉片樣品AsA含量，其余果實(shí)和葉片經(jīng)液氮冷凍后，貯存于-80℃冰箱，用于相關(guān)酶活性測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

AsA含量測(cè)定采用高效液相色譜法[15]。TAsA、DHA含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]。APX、MDHAR、DHAR、GR活性測(cè)定分別參考文獻(xiàn)[21-22]，GSH和GSSG含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[23]。以上測(cè)定均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel 2003處理數(shù)據(jù)并繪圖，DPS 9.5軟件作顯著性檢驗(yàn)分析。

數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析中，未摘葉處理（對(duì)照組）葉片、未摘葉處理（對(duì)照組）果實(shí)、摘葉處理（處理組）葉片和摘葉處理（處理組）果實(shí)分別記為CL、CF、TL和TF。

表1 黑穗醋栗品種及AsA含量（±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 1 Black currant varieties and AsA content(±standard deviation)

2 結(jié)果與分析

2.1 摘葉處理對(duì)黑穗醋栗葉片及果實(shí)AsA含量的影響

由圖1可知，高AsA含量品種亞德和低AsA含量品種利桑佳，其葉片和果實(shí)AsA含量變化趨勢(shì)相同，隨果實(shí)發(fā)育而增加，第3周達(dá)最大值，亞德、布勞德和利桑佳每100 g鮮重果實(shí)AsA含量分別為424.03、256.97和274.96 mg；葉片AsA含量分別為122.36、81.07和70.04 mg；由于果實(shí)膨大而下降，果實(shí)著色期和成熟期（第5～8周）趨于穩(wěn)定。

與未摘葉處理（對(duì)照）相比，摘葉處理明顯增加處理組葉片AsA含量，且差異極顯著（p＜0.01），第3周，亞德摘葉處理組葉片AsA含量是對(duì)照1.31倍；摘葉處理對(duì)果實(shí)AsA含量影響與葉片相反，摘葉處理組中，果實(shí)AsA含量明顯低于對(duì)照，差異極顯著（p＜0.01）。第3周，利桑佳果實(shí)AsA含量是對(duì)照0.87倍，可能是隨葉片相對(duì)減少，果實(shí)AsA含量相對(duì)減少，反之促進(jìn)葉片AsA合成。

圖1 3個(gè)黑穗醋栗品種摘葉處理與對(duì)照組抗壞血酸含量比較Fig.1 Comparison of ascorbic acid content between defoliation and control in three black currant varieties

2.2 摘葉處理對(duì)黑穗醋栗葉片及果實(shí)GSH含量及GSH/GSSG的影響

果實(shí)發(fā)育期內(nèi)，摘葉處理對(duì)葉片及果實(shí)GSH含量無顯著影響（以布勞德為例）。坐果后第1周，果實(shí)GSH含量較低，至第3周略有上升，后緩慢下降，幅度不大（見圖2A）。摘葉處理后，對(duì)照組與處理組果實(shí)GSH含量無顯著差異（P＞0.05），表明葉片相對(duì)減少，對(duì)果實(shí)GSH含量無顯著影響。

3個(gè)品種葉片GSH含量試驗(yàn)周期呈先升后降趨勢(shì)（以布勞德為例）。坐果后第1周含量最低（15.93 mg·100 g-1），后迅速上升，第3周達(dá)峰值（34.02 mg·100 g-1），是第1周2.13倍，隨后由于果實(shí)膨大而有所下降，果實(shí)著色期和成熟期（第5～8周）趨于平穩(wěn)，與果實(shí)AsA含量變化趨勢(shì)相似。隨果實(shí)發(fā)育，果實(shí)GSH/GSSG呈緩慢上升趨勢(shì)（見圖2B），而葉片GSH/GSSG變化幅度較大，但始終低于同期果實(shí)（見圖2B）。葉片GSH/GSSG變化趨勢(shì)與葉片AsA含量變化同步，坐果后1周比值最低，隨果實(shí)發(fā)育，呈先升后降趨勢(shì)，第3周達(dá)峰值，是第1周4.7倍，之后逐漸下降，第8周下降為1.9，與第1周GSH/GSSG相差小。與未摘葉處理（對(duì)照）相比，摘葉處理后處理組葉片GSH/GSSG增加，第4周相差最大，差值為0.5；但摘葉處理對(duì)果實(shí)GSH/GSSG影響小。表明葉片相對(duì)減少影響葉片AsA-GSH循環(huán)。

圖2 摘葉處理布勞德GSH含量及GSH/GSSGFig.2 GSH content and ratio of GSH/GSSG in Brodtrop after defoliation

2.3 摘葉處理對(duì)黑穗醋栗葉片及果實(shí)AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活性影響

植株生長(zhǎng)發(fā)育過程中，3個(gè)品種APX酶活性變化趨勢(shì)相同，但每個(gè)品種葉片和果實(shí)酶活性變化存在差異（見圖3）。

果實(shí)中，APX活性初期活性較高，之后隨果實(shí)發(fā)育，呈下降趨勢(shì)，其中1～3周下降幅度較大，4～8周酶活性變化較小，與果實(shí)AsA含量變化趨勢(shì)相反。葉片中，酶活性1～2周下降，隨后迅速升至第3周達(dá)峰值，亞德、布勞德和利桑佳葉片APX活性分別為39.35、36.37和33.57 U·g-1；之后由于果實(shí)膨大下降，但在果實(shí)成熟期（第7～8周）略升。

與未摘葉處理（對(duì)照）相比，摘葉處理增加處理組果實(shí)APX活性，第3周，亞德品種處理組果實(shí)APX活性是對(duì)照組1.12倍；摘葉處理對(duì)葉片APX活性影響與果實(shí)相反，處理組中，葉片酶活性低于對(duì)照，第3周，利桑佳品種葉片APX活性是對(duì)照0.93倍。可能因葉片減少，導(dǎo)致葉片APX活性降低，但反之促進(jìn)果實(shí)APX活性升高。

3個(gè)品種DHAR活性高低與AsA含量呈正比，亞德和利桑佳，其DHAR活性變化趨勢(shì)相同（見圖4），均隨果實(shí)發(fā)育呈先升后降趨勢(shì)，但與AsA含量變化不同，其酶活性在坐果后第4周達(dá)峰值（滯后1周），亞德、布勞德和利桑佳果實(shí)DHAR活性分別為46.71、42.68和34.58 U·g-1；葉片DHAR活性分別為56.22、53.79和49.48 U·g-1；之后由于果實(shí)膨大下降，果實(shí)成熟期（第7～8周）趨于穩(wěn)定。

與未摘葉處理（對(duì)照）相比，摘葉處理對(duì)處理組果實(shí)DHAR活性無顯著影響；而葉片中，處理組葉片DHAR活性始終高于同期對(duì)照組葉片酶活性，且AsA越高，差異越顯著（p＜0.05）。由此可知，摘葉處理影響葉片DHAR活性，但對(duì)果實(shí)DHAR活性影響小。

圖3 3個(gè)黑穗醋栗品種摘葉處理與對(duì)照APX活性比較Fig.3 Comparison of APX activity between defoliation and control in three black currant varieties

圖4 3個(gè)黑穗醋栗品種摘葉處理與對(duì)照DHAR活性比較Fig.4 Comparison of DHAR activity between defoliation and control in three black currant varieties

3個(gè)品種MDHAR活性變化趨勢(shì)相同（見圖5），以布勞德為例，果實(shí)和葉片MDHAR活性均呈先升后降趨勢(shì)，第4周達(dá)峰值，布勞德果實(shí)和葉片MDHAR活性分別為19.64和24.37 U·g-1。與未摘葉處理（對(duì)照）相比，處理組果實(shí)MDHAR活性降低，而處理組葉片MDHAR活性升高。

隨果實(shí)發(fā)育，3個(gè)品種GR活性變化趨勢(shì)相似，以布勞德為例。自坐果后，GR活性隨果實(shí)發(fā)育呈下降趨勢(shì)（見圖6），1～3周下降幅度較大，4～8周酶活性變化較小，趨于穩(wěn)定，與果實(shí)APX活性變化趨勢(shì)相同。而葉片中，酶活性1～3周迅速上升至第3周達(dá)峰值（26.03 U·g-1），隨后由于果實(shí)膨大而有所下降，但在果實(shí)著色期和成熟期（第5～8周）趨于穩(wěn)定。

與未摘葉處理（對(duì)照）相比，摘葉處理后處理組果實(shí)GR活性降低，但差異不顯著（P＞0.05）；而葉片中，摘葉處理明顯增加處理組第3周葉片GR活性，且差異顯著（p＜0.05），第3周時(shí)處理組葉片GR活性是對(duì)照組1.1倍，而其他坐果時(shí)期差異不顯著。

圖5 布勞德摘葉處理與對(duì)照MDHAR活性比較Fig.5 Comparison of MDHAR activity between defoliation and control in Brodtrop

圖6 布勞德摘葉處理與對(duì)照組GR活性比較Fig.6 Comparison of GR activity between defoliation and control in Brodtrup

3 討論與結(jié)論

AsA是植物體內(nèi)一種非酶抗氧化劑和氧化還原物質(zhì)，在清除活性氧自由基及抗氧化方面具有重要作用。目前，獼猴桃[24]、刺梨[25]、葡萄[26]等園藝作物AsA生物合成和代謝途徑已有深入研究，探討高等植物抗壞血酸含量差異主要影響因素[27]。高等植物AsA生物合成和代謝途徑，特別是明確AsA生物合成L-半乳糖途徑和AsA-GSH循環(huán)再生途徑后，通過研究AsA含量與AsA-GSH循環(huán)再生途徑相關(guān)酶間關(guān)系，可為選育高含量AsA黑穗醋栗新品種提供理論依據(jù)。

本研究以AsA含量差異較大3個(gè)品種亞德、布勞德和利桑佳為試材，摘葉處理并測(cè)定3個(gè)品種相關(guān)酶活性，結(jié)果表明，3個(gè)品種間AsA含量變化趨勢(shì)相似，均隨坐果時(shí)間增加呈先升后降趨勢(shì)，果實(shí)AsA迅速積累期主要在坐果第2～3周，第3周達(dá)最大值，與果實(shí)膨大期吻合，也可能與AsA參與果實(shí)初期細(xì)胞分裂有關(guān)，之后隨果實(shí)膨大AsA含量逐漸下降，與蘋果[28]、獼猴桃[24]AsA積累特點(diǎn)基本一致。摘葉處理后，處理組葉片AsA含量明顯增加，而果實(shí)AsA含量明顯低于對(duì)照，可能是隨葉片相對(duì)減少，果實(shí)AsA含量相對(duì)減少，反之促進(jìn)葉片AsA合成。

越橘[29]、草莓[30]、甜櫻桃[31]、獼猴桃[32]、蘋果[33]等研究表明，AsA含量與DHAR和MDHAR活性密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與AsA-GSH循環(huán)再生途徑相關(guān)的DHAR、MDHAR和GR酶活性先增后減，摘葉處理后葉片DHAR、MDHAR和GR活性增加，而果實(shí)酶活性降低，與AsA含量變化相似。3個(gè)品種MDHAR、GR活性變化趨勢(shì)相似，但不同品種MDHAR和GR活性差異較大。APX活性變化與AsA含量變化相反，第1～3周迅速下降，第3周降至最低值，且與未摘葉處理（對(duì)照）相比，摘葉處理增加果實(shí)APX活性，而葉片降低，與AsA變化恰好相反，APX活性降低有助于確保AsA含量積累與穩(wěn)定。可知，黑穗醋栗果實(shí)和葉片AsA再生能力在維持AsA含量中起重要作用，可能在特定條件和發(fā)育階段調(diào)控AsA水平。

GSH/GSSG比值用來衡量谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)，表明AsA-GSH循環(huán)在AsA生成中起重要作用。GSH/GSSG越高代表GSH量越高，同時(shí)表明更多DHA可通過DHAR和GSH作用轉(zhuǎn)化為AsA[34]。本研究結(jié)果表明，黑穗醋栗果實(shí)GSH/GSSG總是大于葉片，且葉片GSH/GSSG與AsA含量呈正相關(guān)。枝條摘葉處理后，葉片中無論GSH含量還是GSH/GSSG均有下降趨勢(shì)，說明摘葉處理對(duì)葉片抗壞血酸AsA-GSH循環(huán)有影響，而果實(shí)無影響。摘葉處理后，對(duì)照組果實(shí)GR活性略大于處理組，但無顯著差異，說明摘葉處理對(duì)果實(shí)GR活性影響較小。摘葉處理后第3周，葉片GR活性迅速升高，與同期對(duì)照組差異顯著，其他坐果時(shí)期并無顯著差異，與番茄研究結(jié)果一致[10]，表明GSH和GR參與AsAGSH循環(huán)完成黑穗醋栗AsA積累。

目前研究發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和胞外環(huán)境中均含有AsA，且AsA濃度達(dá)毫克級(jí)，AsA在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間均可自由移動(dòng)，說明植物中存在高效AsA跨膜和長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[35]。AsA長(zhǎng)距離運(yùn)輸機(jī)制的提出，使植物庫器官AsA形成機(jī)制復(fù)雜化。本試驗(yàn)摘葉處理對(duì)果實(shí)AsA含量產(chǎn)生影響，因此推測(cè)AsA在葉片和果實(shí)中存在長(zhǎng)距離運(yùn)輸關(guān)系。Qin等通過摘果處理測(cè)試黑穗醋栗AsA是否存在長(zhǎng)距離運(yùn)輸，發(fā)現(xiàn)摘果處理前葉片AsA含量較高，摘果處理后，葉片AsA含量立即下降，果實(shí)AsA水平高于葉片[12]。因此，這種現(xiàn)象可能是黑穗醋栗葉片和果實(shí)之間AsA長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)拈g接證據(jù)，與本試驗(yàn)摘葉處理結(jié)果吻合。

此外，Hancock等通過多種試驗(yàn)證明黑穗醋栗葉片合成的AsA對(duì)果實(shí)AsA積累無影響，認(rèn)為L(zhǎng)-半乳糖是AsA合成途徑，還發(fā)現(xiàn)樹莓AsA主要取決于自身合成能力，不存在AsA運(yùn)輸，但葉片對(duì)果實(shí)糖供應(yīng)能力可能對(duì)樹莓AsA合成具有調(diào)控作用[36]。Hancock等研究指出，AsA從源葉到果實(shí)運(yùn)輸取決于果實(shí)生長(zhǎng)階段，如摘除黑穗醋栗花朵或番茄果實(shí)不影響其果實(shí)AsA積累[36-37]。刺梨在果實(shí)發(fā)育后期開始積累AsA，直至果實(shí)成熟，接近成熟時(shí)AsA積累速率最高，表明果實(shí)內(nèi)AsA積累受不同生長(zhǎng)發(fā)育階段調(diào)控[9]。因此作物不同可能導(dǎo)致AsA積累不同，黑穗醋栗AsA長(zhǎng)距離運(yùn)輸尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

摘葉處理改變果實(shí)表面光照、溫度等外部環(huán)境條件，影響黑穗醋栗果實(shí)AsA最終含量。黑穗醋栗摘葉處理后，葉片減少影響AsA含量及相關(guān)酶活性，果實(shí)和葉片存在差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，摘葉處理后，葉片AsA含量及其他酶活性均增加，而果實(shí)AsA含量、APX及MDHAR活性降低，GSH含量、DHAR和GR活性無變化。本試驗(yàn)初步推斷黑穗醋栗果實(shí)和葉片AsA含量關(guān)系，可用同位素示蹤法驗(yàn)證。黑穗醋栗AsA主要合成途徑是L-半乳糖途徑，其兩種關(guān)鍵酶L-半乳糖脫氫酶和L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶如何在摘果或摘葉中調(diào)控葉片和果實(shí)AsA含量，需進(jìn)一步研究。