任桂萍，張 騰，吳 超，李德山

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

豬圓環(huán)病毒是斷奶仔豬和保育豬常見(jiàn)疾病，發(fā)病率可達(dá)50%，死亡率因豬場(chǎng)條件、繼發(fā)感染情況而異，一般在5%～70%[1]。PCV-2疫苗可有效改善豬圓環(huán)病毒感染情況[2]。

目前國(guó)內(nèi)外防治豬圓環(huán)病毒方法主要為疫苗注射，但免疫效果不明顯，疫苗佐劑添加尤為重要[3]。鋁鹽佐劑最早應(yīng)用于疫苗免疫，抗原吸附強(qiáng)度決定免疫效果，對(duì)機(jī)體有副作用、無(wú)法刺激細(xì)胞免疫[4]；乳劑類佐劑包括弗氏不完全佐劑（IFA）、弗氏完全佐劑（CFA）[5-6]，易造成局部炎癥，注射部位形成肉芽腫及持續(xù)性潰爛，僅用于科研試驗(yàn)；此外還包括天然佐劑，但應(yīng)用受限[7]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)肽聚糖、脂多糖及霍亂毒素等微生物來(lái)源佐劑具有良好佐劑活性[8]，細(xì)胞因子如干擾素、白細(xì)胞介素（IL）-1等免疫調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)。

目前復(fù)合生物佐劑研究較少，施建東等研究復(fù)合佐劑對(duì)狂犬疫苗和乙肝疫苗的免疫增強(qiáng)效果[9-10]。本文選擇巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF和細(xì)菌鞭毛蛋白FliC作為復(fù)合生物佐劑，研究其對(duì)豬圓環(huán)病毒疫苗的免疫增強(qiáng)效果。

活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF[11-12]，具有多種生物學(xué)活性，可誘導(dǎo)造血細(xì)胞增殖和分化，維持粒細(xì)胞系存活[13]；增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬與殺傷功能及嗜酸性粒細(xì)胞殺傷活性[14]。GM-CSF作為細(xì)胞因子，微量高效、作用迅速，與激素效果相似，又稱免疫激素[15]。細(xì)菌鞭毛蛋白FliC可結(jié)合TLR家族受體[16]配體激活機(jī)體免疫應(yīng)答。鞭毛為鼠傷寒沙門(mén)氏菌[17]一部分，細(xì)菌鞭毛蛋白作為特殊的炎性刺激分子，為T(mén)LR5和NLRC4配體，胞外鞭毛蛋白由TLR5識(shí)別，鞭毛細(xì)菌在胞內(nèi)感染時(shí)，由IPAF和Naip5直接識(shí)別[18-19]。FliC可作為免疫佐劑，產(chǎn)生一系列傳遞信號(hào)，激活T淋巴細(xì)胞，調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)，使機(jī)體對(duì)抗原刺激產(chǎn)生反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)免疫佐劑作用[20-21]。細(xì)菌鞭毛蛋白作為最具潛力的候選疫苗佐劑，可誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜IgA，防止黏膜表面局部病原感染[22]。結(jié)合納米粒子的細(xì)菌鞭毛蛋白佐劑可誘導(dǎo)更廣泛的細(xì)胞因子譜[23]。

細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF可參與多種應(yīng)答反應(yīng)，細(xì)菌鞭毛蛋白FliC可刺激天然免疫應(yīng)答，二者具有微量高效等特點(diǎn)，本試驗(yàn)選擇GM-CSF和FliC作為研究對(duì)象，探究復(fù)合生物佐劑增強(qiáng)豬圓環(huán)疫苗免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工程菌

SUMO-GM-CSF和SUMO-FliC工程菌，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥教研室保存。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠，6周齡雌性，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.3 生化試劑

IPTG、溶菌酶、氨芐青霉素（購(gòu)自TaKaRa公司）；親和層析柱HisTrapTM FF crude colum購(gòu)自GE公司；SUMO Protease-I（由本實(shí)驗(yàn)室純化獲得）；蛋白Marker購(gòu)自Fermenta公司。

1.1.4 疫苗

哈藥豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（滅活前每毫升含豬圓環(huán)病毒2型LG株不低于105.5TCID50）

1.2 方法

1.2.1 GM-CSF蛋白優(yōu)化表達(dá)及制備

1.2.1.1 SUMO-GM-CSF融合蛋白誘導(dǎo)劑濃度確定

將-20℃保存SUMO-GM-CSF工程菌4℃融化，取上述菌液以1%含量接種于4個(gè)氨芐抗性液體培養(yǎng)基。接種后置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2～3 h后，至OD600值約0.5時(shí)，分別加入終濃度為1、0.75、0.5、0.25 mmol·L-1IPTG，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，分別制備未誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)后上清、沉淀蛋白樣品，通過(guò)15%SDS-PAGE電泳分析，在相同誘導(dǎo)溫度、時(shí)間，比較不同IPTG終濃度時(shí)SUMOGM-CSF蛋白表達(dá)量差異。

1.2.1.2 SUMO-GM-CSF融合蛋白誘導(dǎo)溫度確定

將-20℃保存SUMO-GM-CSF工程菌4℃融化，取上述菌液以1%含量接種于3個(gè)氨芐抗性液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2～3 h后，至OD600值約0.5時(shí)，加入IPTG，分別37、25、16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，制備未誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)后上清，誘導(dǎo)后沉淀蛋白樣品，通過(guò)15%SDSPAGE電泳分析，在相同IPTG終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間，比較不同誘導(dǎo)溫度時(shí)SUMO-GM-CSF蛋白表達(dá)量差異。

1.2.1.3 SUMO-GM-CSF融合蛋白誘導(dǎo)時(shí)間確定

將-20℃保存SUMO-GM-CSF工程菌4℃融化，取上述菌液以1%含量接種于3個(gè)氨芐抗性液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2～3 h后，至OD600值約0.5時(shí)，加入IPTG，分別誘導(dǎo)2、4和6 h，培養(yǎng)結(jié)束后，制備未誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)后上清，誘導(dǎo)后沉淀蛋白樣品，通過(guò)15%SDS-PAGE電泳分析，在相同誘導(dǎo)溫度、IPTG終濃度，比較不同誘導(dǎo)時(shí)間SUMO-GM-CSF蛋白表達(dá)量差異。

1.2.1.4 SUMO-GM-CSF融合蛋白變性及復(fù)性

經(jīng)大瓶培養(yǎng)的SUMO-GM-CSF菌液，離心棄上清，沉淀物用PBS（pH 7.4）溶液懸起，按照0.001 g·mL-1加入溶菌酶。冰上放置1 h后超聲破碎，每次超聲波破碎10 s，重復(fù)3～5次，直至菌液無(wú)粘稠物。破碎后收集破碎沉淀，PBS溶液洗滌沉淀，重復(fù)2次。洗滌后，用含有8 mol·L-1尿素變性液溶解沉淀，4℃冰箱中放置12 h后，10 000 r·min-1，4℃離心30 min，吸取上清液，將上清液緩慢滴加擴(kuò)散至含2 mol·L-1尿素復(fù)性液中，滴加至蛋白濃度為0.8～1 mg·mL-1即可。復(fù)性完成后，蛋白經(jīng)透析，置換到PBS（pH 7.0）以備純化。

1.2.1.5 GM-CSF蛋白純化

選擇重組原核表達(dá)載體SUMO載體上含有6個(gè)組氨酸（His）標(biāo)簽，可通過(guò)Ni-NTA柱親和層析，使用AKTA purifier100蛋白純化系統(tǒng)純化復(fù)性后的SUMO-GM-CSF蛋白。通過(guò)BCA計(jì)算濃度，按照質(zhì)量比1∶10加入SUMO蛋白酶，置于4℃冰箱過(guò)夜。第2天，將酶切后產(chǎn)物經(jīng)AKTA purifier 100蛋白層析系統(tǒng)，通過(guò)Ni-NTA柱二次親和，流穿液即為目的蛋白GM-CSF。取樣，作15%SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.2 FliC蛋白發(fā)酵誘導(dǎo)條件優(yōu)化及制備

1.2.2.1 SUMO-FliC工程菌發(fā)酵誘導(dǎo)時(shí)間確定

發(fā)酵鑒定正確的SUMO-FliC工程菌菌體，開(kāi)始誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)溫度，IPTG濃度相同條件下，分別在誘導(dǎo)2、4、6、8 h時(shí)取發(fā)酵菌樣，制備誘導(dǎo)后全菌，誘導(dǎo)后上清蛋白樣品，通過(guò)15%SDS-PAGE電泳分析對(duì)比不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)量影響。

1.2.2.2 SUMO-FliC工程菌發(fā)酵誘導(dǎo)IPTG濃度確定

發(fā)酵鑒定正確的SUMO-FliC工程菌菌體，開(kāi)始誘導(dǎo)后誘導(dǎo)溫度和時(shí)間相同條件下，分別加入終濃度為0.75、0.5、0.25 mmol·L-1IPTG。誘導(dǎo)放罐后取發(fā)酵菌樣制備誘導(dǎo)后全菌，誘導(dǎo)后上清蛋白樣品通過(guò)15%SDS-PAGE電泳分析，對(duì)比不同誘導(dǎo)劑終濃度對(duì)表達(dá)量影響。

1.2.2.3 SUMO-FliC工程菌發(fā)酵誘導(dǎo)溫度確定

發(fā)酵鑒定正確的SUMO-FliC工程菌菌體，開(kāi)始誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)劑終濃度，誘導(dǎo)時(shí)間相同條件下，分別設(shè)置誘導(dǎo)溫度20、25、30、37℃。誘導(dǎo)放罐后取發(fā)酵菌樣，分別制備誘導(dǎo)后全菌，誘導(dǎo)后上清蛋白樣品，通過(guò)15%SDS-PAGE電泳分析，對(duì)比不同誘導(dǎo)溫度對(duì)表達(dá)量影響。

1.2.2.4 FliC蛋白純化

收集發(fā)酵培養(yǎng)的SUMO-FliC菌液，超聲破碎沉淀，純化融合蛋白。流穿液即為目的蛋白FliC。

1.2.3 GM-CSF與FliC蛋白作為復(fù)合生物佐劑免疫增強(qiáng)效果檢測(cè)

取5組BALB/c雌性小鼠，每組15只。

第1組為空白組，注射磷酸鹽；

第2組為單獨(dú)疫苗組，注射商品化豬圓環(huán)疫苗；

第3組為免疫佐劑①組，注射疫苗+GM-CSF（12.5 mg· kg-1）；

第4組為免疫佐劑②組，注射疫苗+FliC（5 mg·kg-1）；

第5組為GM-CSF與FliC混合疫苗組，注射疫苗+GM-CSF（12.5 mg·kg-1）+FliC（5 mg·kg-1）。

免疫程序：按照體重，采用皮下注射方法，五組分別注射磷酸鹽，單獨(dú)疫苗，疫苗+GM-CSF，疫苗+FliC及疫苗+GM-CSF+FliC。分別于D2、D4、D6、D8、D10眼球取血，每次每組取3只分離血清，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清中抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SUMO-GM-CSF融合蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化及制備

2.1.1 誘導(dǎo)劑濃度

制備蛋白樣品作SDS-PAGE分析，如圖1所示，在約33 ku處有目的蛋白，且當(dāng)IPTG終濃度為0.25 mmol·L-1時(shí)融合蛋白表達(dá)量最高。因此選擇IPTG 0.25 mmol·L-1為此蛋白最佳誘導(dǎo)劑濃度。

2.1.2 誘導(dǎo)溫度

制備蛋白樣品作SDS-PAGE分析。如圖2所示，在約33 ku處有目的蛋白，且當(dāng)溫度為37℃時(shí)融合蛋白表達(dá)量最高。故選擇溫度為37℃作為此蛋白最佳誘導(dǎo)溫度。

圖1 誘導(dǎo)劑濃度確定Fig.1 Determination of inducer concentration

圖3 誘導(dǎo)溫度確定Fig.3 Determination of induced temperature

2.1.3 誘導(dǎo)時(shí)間

制備蛋白樣品，作SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在約33 ku處有目的蛋白，且誘導(dǎo)4 h時(shí)融合蛋白表達(dá)量高。故選擇誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。根據(jù)SDS-PAGE分析，確定SUMO-GM-CSF蛋白最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG終濃度0.25 mmol·L-1、溫度37℃，誘導(dǎo)4 h。

圖3 誘導(dǎo)時(shí)間確定Fig.3 Determination of induction time

2.1.4 SUMO-GM-CSF融合蛋白純化

將誘導(dǎo)后獲得SUMO-GM-CSF陽(yáng)性菌體破菌離心，變性液復(fù)性液處理沉淀物，離心收集上清，過(guò)AKTA purfier 100系統(tǒng)經(jīng)Ni-NTA樹(shù)脂親和層析，得到純化后SUMO-GM-CSF融合蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖4。將融合蛋白加入SUMO蛋白酶切除融合標(biāo)簽后，二次親和層析得到最終GM-CSF蛋白。通過(guò)SDS-PAGE可知在約13 ku處有明顯目的條帶，如圖5所示。根據(jù)SDS-PAGE分析，得到純化后約13 ku GM-CSF蛋白。

圖4 SUMO-GM-CSF一次親和Fig.4 The first affinity of SUMO-GM-CSF

圖5 二次親和后GM-CSFFig.5 Obtained GM-CSF after the second affinity

2.2 SUMO-FliC融合蛋白發(fā)酵誘導(dǎo)條件優(yōu)化及制備

2.2.1 發(fā)酵誘導(dǎo)時(shí)間

制備蛋白樣品，15%SDS-PAGE電泳分析。由圖6可知，SDS-PAGE在約65 ku處有明顯目的條帶，且誘導(dǎo)6 h時(shí)融合蛋白表達(dá)量最高。

2.2.2 發(fā)酵誘導(dǎo)劑濃度

制備蛋白樣品，15%SDS-PAGE電泳分析。由圖6可知，SDS-PAGE在約65 ku處有明顯目的條帶，表達(dá)量無(wú)明顯差別，選擇最低IPTG終濃度0.25 mmol·L-1。

2.2.3 發(fā)酵誘導(dǎo)溫度

制備蛋白樣品，15%SDS-PAGE電泳分析。由圖7可知，SDS-PAGE在約65 ku處有明顯目的條帶，誘導(dǎo)溫度25℃時(shí)表達(dá)量最高。根據(jù)SDS-PAGE分析，確定SUMO-FliC蛋白發(fā)酵最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度0.25 mmol·L-1、溫度25℃，誘導(dǎo)6 h。

2.2.4 SUMO-FliC融合蛋白純化

破碎發(fā)酵培養(yǎng)所獲SUMO-FliC陽(yáng)性菌體，將破碎后菌液置于中空纖維柱，收集澄清液體。將上清液通過(guò)AKTA purfier 100系統(tǒng)經(jīng)Ni-NTA樹(shù)脂親和層析得到純化后SUMO-FliC融合蛋白。將融合蛋白加入SUMO蛋白酶切除融合標(biāo)簽后，二次親和層析得到最終FliC蛋白。通過(guò)SDS-PAGE可知在約46 ku處有明顯目的條帶，如圖8所示。根據(jù)SDS-PAGE分析，得到純化后約46 ku FliC蛋白。

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度確定Fig.6 Determination of induction time and inducer concentration

圖7 誘導(dǎo)溫度確定Fig.7 Determination of induced temperature

圖8 FliC蛋白純化SDS-PAGE電泳Fig.8 SDS-PAGE analysis of purfied FliC protein

2.3 GM-CSF與FliC蛋白作為復(fù)合生物佐劑免疫增強(qiáng)效果檢測(cè)

在小鼠免疫后第2、4、6、8、10天眼球取血，離心得到血清。經(jīng)ELISA測(cè)定不同組小鼠體內(nèi)抗體水平，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，免疫后第2天，與空白組相比，其他四組抗體效價(jià)均顯著升高，但疫苗+GM-CSF+FliC組增幅明顯大于單獨(dú)疫苗組和單獨(dú)佐劑組；第2～8天，單獨(dú)疫苗組抗體效價(jià)逐漸下降，復(fù)合佐劑組和單獨(dú)佐劑組穩(wěn)步上升；第8天時(shí)，復(fù)合佐劑組抗體效價(jià)達(dá)峰值，顯著高于其他各組；第10天，單獨(dú)疫苗組已失去免疫效果，但復(fù)合佐劑組維持較高水平。由此可見(jiàn)，GM-CSF和FliC均具有增強(qiáng)免疫效果生物學(xué)活性，且GM-CSF與FliC共同注射組較其他各組效果更好，迅速刺激小鼠免疫系統(tǒng)。

圖9 GM-CSF與FliC蛋白免疫小鼠10 d內(nèi)抗體變化Fig.9 Antibody titer after vaccination within 10 days

3 討 論

3.1 生物免疫佐劑選擇

獸用免疫佐劑包括鋁鹽佐劑、油乳佐劑、微生物類佐劑、中藥類佐劑、細(xì)胞因子類佐劑、化學(xué)合成類等。細(xì)胞因子作為機(jī)體內(nèi)重要因子，具有微量高效優(yōu)點(diǎn)，調(diào)控固有免疫反應(yīng)及獲得性免疫反應(yīng)效率高、副作用少。鞭毛蛋白作為免疫佐劑，不會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生超敏反應(yīng)，可增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原攝取、加工和遞呈能力；低劑量亦可發(fā)揮佐劑效應(yīng)[24-25]。

本研究選擇粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）與鼠傷寒沙門(mén)氏菌的鞭毛蛋白（FliC）作為生物免疫佐劑，與單獨(dú)疫苗組相比，添加生物免疫佐劑有效增加疫苗免疫效果，提高抗體效價(jià)，起效迅速且延長(zhǎng)免疫作用時(shí)間，在第8天至第10天單獨(dú)疫苗組已失去作用時(shí)，GM-CSF+FliC作為生物佐劑仍保持相對(duì)較高水平。

3.2 復(fù)合免疫佐劑應(yīng)用

本試驗(yàn)選用粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），鼠傷寒沙門(mén)氏菌的鞭毛蛋白（FliC），GM-CSF可有效促進(jìn)抗原遞呈，F(xiàn)liC可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子，作為復(fù)合生物佐劑聯(lián)合使用時(shí)，免疫效果增強(qiáng)。本研究中，對(duì)比疫苗+GM-CSF組使用效果，GM-CSF+FliC復(fù)合生物佐劑對(duì)疫苗免疫效果更強(qiáng)；對(duì)比GM-CSF單獨(dú)作為佐劑，GM-CSF+FliC具有免疫作用持久和高水平應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)。兩種以上免疫佐劑混合成復(fù)合佐劑，可有效發(fā)揮疫苗增強(qiáng)作用。

防控豬圓環(huán)病毒關(guān)鍵是疫苗免疫，但全病毒滅活疫苗免疫效果不理想，難以獲得高效價(jià)抗體水平[26]。本研究改良豬圓環(huán)病毒疫苗效果，復(fù)合生物佐劑可有效提高疫苗效果，到達(dá)預(yù)期目的，解決多數(shù)動(dòng)物疫苗抗原性差、作用時(shí)間短等問(wèn)題，為養(yǎng)殖動(dòng)物疫苗改良應(yīng)用提供新思路。

3.3 發(fā)酵工程應(yīng)用

發(fā)酵工程作為產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化必要手段，其合理應(yīng)用可節(jié)省人力物力。利用發(fā)酵罐擴(kuò)大產(chǎn)品獲取量，經(jīng)發(fā)酵得到蛋白濃度高，避免后期煩瑣濃縮過(guò)程及產(chǎn)品浪費(fèi)。近年來(lái)，隨著大腸桿菌基因重組技術(shù)與高密度發(fā)酵技術(shù)結(jié)合，天然蛋白可大量生產(chǎn)。重組大腸桿菌細(xì)胞高密度發(fā)酵培養(yǎng)是獲得高外源性蛋白產(chǎn)率的重要方法，可減少培養(yǎng)體積，強(qiáng)化下游分離提取，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

4 結(jié)論

本研究確定GM-CSF和FliC蛋白最佳表達(dá)條件，即GM-CSF在IPTG終濃度為0.25 mmol·L-1、溫度為37℃時(shí)誘導(dǎo)4 h，F(xiàn)liC在IPTG終濃度0.25 mmol·L-1、溫度為25℃時(shí)誘導(dǎo)6 h，成功制備具有生物活性的GM-CSF和FliC蛋白。GM-CSF+FliC作為復(fù)合生物佐劑與豬圓環(huán)病毒疫苗共同注射小鼠，有效增強(qiáng)體液免疫，可作為新型復(fù)合佐劑。