李景富，張曉春，姜景彬，楊歡歡，趙婷婷，許向陽

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄生長受多種環(huán)境因素調(diào)控。溫度較低、土壤水分匱乏、土壤高鹽高堿等逆境影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)。研究植物抗逆應(yīng)答機(jī)制，明確植物基因調(diào)控機(jī)制，挖掘可供利用抗逆基因資源在農(nóng)作物抗逆品種選育工作中具有重要意義。

VIGS（Virus-induced gene silencing）是高等植物轉(zhuǎn)錄后的一種基因沉默現(xiàn)象，當(dāng)宿主細(xì)胞遇到外源病毒入侵與外源產(chǎn)生斥性時可引發(fā)[1]。RNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（RNA-mediated gene silencing）發(fā)生在RNA水平上，廣泛存在各類生物體中，該技術(shù)以核酸序列特異性降解機(jī)制為理論依據(jù)，在真菌中被稱為基因消除（Gene quelling），在植物中則被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing,PTGS）[2]。病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）應(yīng)用廣泛。目前，VIGS已應(yīng)用于水稻、番茄、擬南芥等[3]。傳統(tǒng)鑒定植物基因功能方法涉及植物遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因后代鑒定篩選，周期相對較長[4]。病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)（VIGS）相比于傳統(tǒng)基因功能分析方法，具有高效率、高通量等特點(diǎn)，在較大范圍基因功能鑒定分析中應(yīng)用廣泛。此外，VIGS技術(shù)易于操作，沉默后可在短時間內(nèi)觀察功能缺失表型[5]。近年來，在植物抗病抗逆、代謝調(diào)控等相關(guān)基因功能鑒定中，VIGS應(yīng)用廣泛[6]。

在惡劣環(huán)境因素影響下，植株果實(shí)品質(zhì)降低、產(chǎn)量減少。植物生長和發(fā)育過程中，ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子家族基因在幫助調(diào)控植物應(yīng)對復(fù)雜逆境脅迫時占據(jù)主導(dǎo)地位。ZF-HD家族基因在多種作物中進(jìn)化、分類和功能研究較多，但與番茄ZF-HD轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)功能研究相對較少，逆境脅迫方面研究更少。因此本試驗(yàn)研究番茄ZF-HD家族基因中SL-ZH22基因功能及非生物脅迫下表達(dá)模式，確定該基因在番茄植株應(yīng)對逆境脅迫中的作用。

通過VIGS技術(shù)可有效抑制特定基因表達(dá)，為明確植物特定基因控制的植物性狀，當(dāng)目的基因表達(dá)受抑制時，根據(jù)植物表型變化確定該基因功能，為確定基因功能提供便捷高效方法。為研究SL-ZH22基因在番茄植株耐鹽性中的功能，本試驗(yàn)從番茄植株中提取目的基因并作VIGS處理，驗(yàn)證分析沉默基因耐鹽性功能。利用VIGS基因沉默原理，通過對比觀察植株表型變化、測定植株抗性相關(guān)生理生化指標(biāo)，確定目的基因與植株抗性關(guān)系，進(jìn)一步分析目的基因調(diào)控機(jī)制，為番茄抗逆品種選育研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為番茄栽培品種Moneymaker，2018年1月種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站連棟溫室中，播種時使用草炭蛭石混合物（3∶1），摹擬自然環(huán)境光溫。

1.2 方法

待Moneymaker長至四葉一心時，取18株長勢良好番茄幼苗，其中9株作基因沉默處理，其余為對照。用無菌水將四葉期番茄幼苗根部沖洗干凈，在裝有Hoagland's營養(yǎng)液的100 mL錐形瓶中預(yù)培養(yǎng)2 d，非生物脅迫處理沉默后番茄植株。分別在0、3、6、12、24 h觀察，對比植株表型變化。各時間點(diǎn)取樣，用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

1.2.1 目標(biāo)片段擴(kuò)增和載體構(gòu)建

提取番茄葉片總RNA并合成cDNA。利用SLZH22基因mRNA序列，結(jié)合Primer5設(shè)計(jì)特異的含有雙酶切位點(diǎn)（Eco R I和Bam H I）及保護(hù)堿基的引物，瓊脂糖凝膠電泳分析得到PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物膠回收，回收產(chǎn)物測序驗(yàn)證分析，PCR純化試劑盒（TaKaRa）純化，純化產(chǎn)物克隆到TRV2載體并測序。

從含TRV2菌液中提取質(zhì)粒，利用Eco R I和Bam H I酶切TRV2質(zhì)粒和目的片段，將酶切后質(zhì)粒與目的片段經(jīng)T4DNA連接酶連接，連接成功的載體命名為CM22。將CM22載體導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，鑒定菌液PCR。并將含有CM22重組載體的大腸桿菌DH5α菌液與TRV2-PDS重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，命名為N22。八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase，PDS），是一種類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶，如果該基因在植株內(nèi)被成功沉默，植株會出現(xiàn)白化現(xiàn)象。故本試驗(yàn)將其作為指示基因，待接種TRV2-PDS載體植株葉片出現(xiàn)褪綠白化后，開展后續(xù)研究[7]。

1.2.2 番茄幼苗侵染方法

待Moneymaker番茄幼苗長至四葉一心時，移取長勢良好、尺寸相近番茄幼苗至營養(yǎng)缽中，用于后續(xù)農(nóng)桿菌接種。

取1 mL注射器將混合菌液注射至番茄幼苗葉片與嫩莖中，每次接種均3次生物學(xué)重復(fù)。

按條件培養(yǎng)侵染番茄植株后，侵染17 d后番茄幼苗出現(xiàn)白化現(xiàn)象。從頂部生長點(diǎn)開始向底部逐漸擴(kuò)散呈整體白化現(xiàn)象，番茄葉片由葉柄開始向葉脈擴(kuò)散逐漸出現(xiàn)白化現(xiàn)象。2個月后白化現(xiàn)象仍顯著存在。證明指示基因PDS在番茄幼苗中沉默成功且效果穩(wěn)定。

1.2.3 基因沉默效率確定方法

分別從沉默處理25 d后植株和對照植株摘取葉片，提取RNA并合成cDNA，并作qRT-PCR確定基因沉默效率。

1.2.4 基因沉默植株非生物脅迫下表達(dá)量分析

綜合SL-ZH22基因表達(dá)模式對比效果與逆境處理效果，選擇高鹽脅迫開展后續(xù)試驗(yàn)。待接種含TRV-PDS農(nóng)桿菌的植株白化比較完全時，按時間點(diǎn)高鹽脅迫處理接種含重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌植株并取樣，在樣品中提取RNA并合成cDNA，通過qRTPCR(實(shí)時熒光定量PCR)確定基因沉默效率。

1.3 生理生化指標(biāo)測定

1.3.1 SOD、POD、PRO和MDA測定

本試驗(yàn)所有生理生化指標(biāo)測定均使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)試劑盒。生理生化指標(biāo)測定前，預(yù)測定3個預(yù)期差異較大樣本。通過試驗(yàn)測定后與預(yù)測一致，證明試劑盒與操作可信。

1.3.2 DAB與NBT植物組織染色

DAB與植物組織中H2O2反應(yīng)生成棕紅色沉淀，NBT與植物組織中O2-反應(yīng)生成深藍(lán)色沉淀[8]。根據(jù)該化學(xué)反應(yīng)原理，通過DAB和NBT染色方法觀察番茄葉片H2O2和O2-積累情況，具體染色步驟參照文獻(xiàn)[9]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果利用Graph Pad6軟件處理數(shù)據(jù)并制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化侵染番茄植株侵染效果

侵染番茄植株并按條件培養(yǎng)，17 d后被侵染番茄幼苗逐漸白化，葉片白化現(xiàn)象由葉柄向葉脈擴(kuò)散，整體白化現(xiàn)象從番茄頂部生長點(diǎn)開始向底部擴(kuò)散，2個月后再次觀察，發(fā)現(xiàn)植株仍存在白化現(xiàn)象，證明指示基因PDS在番茄幼苗中沉默成功，且效果穩(wěn)定。將N22侵染過的番茄植株取材，分析表達(dá)量。

2.2 沉默效果初步驗(yàn)證與分析

分別初步驗(yàn)證正常植株、TRV2空載、SLZH22沉默后植株。結(jié)果顯示，正常植株和TRV2空載植株表達(dá)量無明顯變化，SL-ZH22表達(dá)量顯著降低，證明植株沉默成功。

2.3 沉默植株鹽脅迫表型觀察結(jié)果

因0、3、12、24 h時鹽脅迫下植株變化不明顯，6 h時最明顯，故將SL-ZH22基因沉默植株選取在6 h下觀察。由圖1可知，鹽脅迫處理6 h時，發(fā)現(xiàn)基因沉默后植株比對照植株萎蔫嚴(yán)重。

圖1 鹽處理下CK植株和SL-ZH22基因沉默植株表型變化Fig.1 Phenotype change of CK and SL-ZH22 gene silencing plants under salt stress

2.4 沉默前后番茄植株表達(dá)量對比結(jié)果

由圖2可知，在0、3、6、12 h時T2空載和未沉默植株SL-ZH22基因表達(dá)量無明顯變化，沉默處理后植株各時間點(diǎn)表達(dá)量均較低。

2.5 沉默前后非生物脅迫生理生化指標(biāo)測定結(jié)果

2.5.1 超氧化物歧化酶SOD活性檢測結(jié)果

研究表明，高鹽脅迫下，番茄生理代謝中抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，高鹽逆境環(huán)境導(dǎo)致番茄植株中抗氧化酶SOD活性增強(qiáng)。

試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。未沉默植株經(jīng)鹽脅迫處理后SOD酶活性升高，SL-ZH22基因沉默后未脅迫植株SOD酶活性無明顯變化，高鹽脅迫后植株SOD酶活性降低，由此推測SL-ZH22基因可能參與SOD酶形成。

圖2 鹽處理下沉默SL-ZH22前后對比結(jié)果Fig.2 Comparison result before/after silencing SL-ZH22 under salt stress

圖3 逆境下沉默前后SOD酶活對比結(jié)果Fig.3 Comparison result of SOD enzyme activity before/after silencing under salt stress

2.5.2 過氧化物酶POD活性檢測結(jié)果

由圖4可知，基因沉默前鹽脅迫番茄植株P(guān)OD酶活性高于對照，而沉默SL-ZH22基因后發(fā)現(xiàn)未脅迫處理植株P(guān)OD酶活并無顯著變化，而鹽脅迫處理后POD酶活性低于對照植株。由此可推測SLZH22基因可能參與番茄植株P(guān)OD酶形成。

2.5.3 脯氨酸PRO測定結(jié)果

由圖5可知，在SL-ZH22基因沉默前鹽脅迫處理番茄植株P(guān)RO表達(dá)率高于對照，SL-ZH22基因沉默后正常植株P(guān)RO表達(dá)率無明顯變化，鹽脅迫處理后植株P(guān)RO表達(dá)率顯著升高。

2.5.4 丙二醛MDA測定結(jié)果

由圖6可知，基因沉默前，鹽脅迫處理番茄植株MDA表達(dá)率高于對照。SL-ZH22基因沉默后未鹽脅迫處理番茄植株MDA表達(dá)率無顯著差異，脅迫處理后植株MDA表達(dá)率明顯低于對照。

圖4 逆境下沉默前后POD酶活對比結(jié)果Fig.4 Comparison result of POD enzyme activity before/after silencing under salt stress

圖5 逆境下沉默前后PRO對比結(jié)果Fig.5 Comparison result of PRO activity before/after silencing under salt stress

圖6 逆境下沉默前后MDA對比結(jié)果Fig.6 Comparison result of MDA content before/aftersilencing under salt stress

2.5.5 活性氧測定結(jié)果

由圖7、8可知，DAB染色后，未沉默前鹽脅迫處理植株葉片顏色比正常植株深，SL-ZH22基因沉默后，鹽脅迫處理后植株葉片基部染色相對較深。NBT試劑染色后，未脅迫處理基因沉默植株葉片與正常葉片相比顏色較深，基因沉默葉片在鹽脅迫下差別明顯，基因沉默處理葉片鹽脅迫下著色比正常葉片深。

圖7 DAB染色組Fig.7 DAB colored team

圖8 NBT染色組Fig.8 NBT colored team

3 討論與結(jié)論

本研究通過分析沉默SL-ZH22前后鹽脅迫處理基因表達(dá)量，結(jié)果表明基因沉默植株鹽脅迫處理后表達(dá)量差異顯著，初步明確SL-ZH22基因可能與番茄耐鹽性有關(guān)。植物體細(xì)胞內(nèi)存在各種抗氧化物質(zhì)，如抗氧化分子和抗氧化酶等，抗氧化物質(zhì)通過直接或間接方式清除植物體內(nèi)活性氧，避免細(xì)胞膜損傷，也可保護(hù)生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等免受自由基氧化損害。其在植物應(yīng)對逆境脅迫，維持生長發(fā)育過程中有重要作用[10]。

植物遭遇逆境環(huán)境時，體內(nèi)會積累大量活性氧（ROS），嚴(yán)重?fù)p傷植物機(jī)體。但植物體經(jīng)過漫長進(jìn)化后，可形成復(fù)雜的抗氧化酶體系減少植物體內(nèi)ROS積累，抗氧化體系中不僅含維生素C（Vtiamin C）、β-胡蘿卜素（β-carotene）等非酶類抗氧化物質(zhì)，還包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPX）等酶類抗氧化劑[11]。在植物抗氧化系統(tǒng)中，SOD首先發(fā)揮作用，在氧化酶系統(tǒng)中處于核心位置。SOD在抗氧化體系中催化O2-·發(fā)生岐化反應(yīng)，O2-·被分解成過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2），抗壞血酸和過氧化氫酶又可將H2O2分解為H2O和O2，消除O2-·對細(xì)胞的氧化脅迫作用。該氧化酶在維持植物體自由基產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡過程中發(fā)揮重要作用[12]。但不同植物品種對逆境抵抗存在差異，SOD酶活性不同[13]。本試驗(yàn)番茄品種Moneymaker在鹽脅迫條件下未沉默植株SOD酶活性明顯高于正常植株，沉默后未脅迫處理植株SOD酶活性無明顯變化，但高鹽脅迫處理植株SOD酶活性卻低于對照，推測SL-ZH22基因參與SOD酶形成；POD酶是膜保護(hù)系統(tǒng)重要組成部分，結(jié)合其他酶減少植物體內(nèi)自由基及過氧化氫等造成的損害[14]。

本研究中正常番茄植株在逆境處理后POD酶活性比對照植株高，沉默SL-ZH22基因后，正常植株無明顯變化，鹽脅迫處理后植株P(guān)OD酶活低于對照，說明植物抗鹽系統(tǒng)中SL-ZH22基因可能參與POD酶形成；PRO是植物中常見滲透物質(zhì)，植物在脅迫條件下可在體內(nèi)積累大量脯氨酸，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓，保持胞內(nèi)滲透平衡，有效避免滲透脅迫造成傷害，還有清理自由基作用，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對植物抵抗逆境具有重要意義[15]。PRO在基因沉默前后有無鹽脅迫處理植株中均無顯著變化，而沉默SL-ZH22基因鹽脅迫處理后，植株中PRO含量增多，可證明SL-ZH22基因與植物抗逆系統(tǒng)中PRO形成無關(guān)；MDA是植物細(xì)胞在逆境環(huán)境中發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，常作為膜質(zhì)過氧化指標(biāo)[16]，本研究通過沉默SL-ZH22基因鹽脅迫處理后發(fā)現(xiàn)植株MDA活性低于對照，因此推測SL-ZH22基因與植物逆境脅迫中MDA產(chǎn)生無關(guān)。

番茄器官中葉片表面積最大，而氣孔與番茄水分控制與氣體交換密切相關(guān)，外部環(huán)境極易影響植株體氣孔閉合，改變植株形態(tài)和結(jié)構(gòu)[17]。氣孔觀察結(jié)果顯示，番茄植株在鹽脅迫環(huán)境中部分氣孔處于關(guān)閉狀態(tài)，與齊紅巖番茄葉片氣孔在水分脅迫下易閉合結(jié)論一致[18]。本研究沉默SL-ZH22基因后植株在鹽脅迫下氣孔通度增大，證明SLZH22基因可能提高番茄耐鹽能力。植物細(xì)胞在有氧代謝過程中有活性氧（ROS）產(chǎn)生，ROS中包括很多含氧自由基和含氧分子，如超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）等含氧自由基；過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（O2-）等非自由基形成的含氧分子[19]。外界環(huán)境中逆境脅迫打破植物體中自由基產(chǎn)生與消除動態(tài)平衡，由此造成的活性氧積累會導(dǎo)致有害膜脂過氧化反應(yīng)等，傷害植物[20]。本試驗(yàn)檢測兩種重要ROS分別為過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2-）。使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和氯化硝基四氮唑（NBT）檢測H2O2和O2-，DAB遇H2O2會產(chǎn)生淡紅棕色沉淀物質(zhì)，NBT遇O2-產(chǎn)生深藍(lán)色不溶性甲醛化合物。沉默SL-ZH22基因植株葉片顏色較沉默前更深，沉默后鹽處理葉片顏色較沉默前更深，說明SL-ZH22基因減少番茄活性氧產(chǎn)生，證明SLZH22基因可增強(qiáng)番茄植株耐鹽能力。

本研究開展SL-ZH22基因VIGS功能驗(yàn)證，通過植株沉默后表型觀察、基因表達(dá)量、組織學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測定表明SL-ZH22基因沉默后番茄植株耐鹽能力明顯下降。因此，推測SLZH22基因可能提高番茄耐鹽能力。