文景芝，徐 瑩，張卓群，宋光梅，陳宇飛，趙鈺琦，高新穎，賈夢(mèng)瑱，朱加楠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆疫霉根腐病（Phytophthora root rot）是由大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann and Gerdemann）引起的世界性土傳病害，可造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。

生育期大豆均可被大豆疫霉侵染，出苗前侵染種子引起爛種，出苗后侵染根部和莖基部導(dǎo)致地上部枯萎。大豆疫霉以卵孢子形式在病殘?bào)w或土壤中越冬并作為初侵染源[2]，當(dāng)土壤溫濕度適宜時(shí)，卵孢子萌發(fā)形成孢子囊，孢子囊由頂口釋放游動(dòng)孢子，游動(dòng)孢子是大豆疫霉侵染寄主主要形式，游動(dòng)一定時(shí)間后便可成囊、萌發(fā)[3]，通過芽管穿透寄主表皮侵入[4]。

種子分泌物作為種子際一部分，對(duì)種子周圍病原菌生長和發(fā)育尤為重要[5]。種子分泌物中營養(yǎng)物質(zhì)可為病原菌生長提供能量[6]，其抑菌物質(zhì)可抑制病原菌生長發(fā)育[7]，抵抗病原菌入侵，與植物抗病性關(guān)系密切。

大量研究證明種子分泌物中含有抑菌物質(zhì)，如羽扇豆（Lupinus albus）種子分泌物中含有大量幾丁質(zhì)酶，可有效抑制病原真菌生長[8]；菜豆（Phaseolus vulgaris L.）抗病品種種子分泌物抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌絲生長，與種子分泌物中含有較多酚類物質(zhì)有關(guān)[9]。大豆抗病品種與大豆疫霉非親和互作涉及一系列復(fù)雜機(jī)制，包括固有抗病性和誘導(dǎo)抗病性。大豆疫霉根腐病是典型“基因?qū)颉辈『10]，大豆疫霉接觸寄主時(shí)，寄主大豆抗病基因（Rps gene）識(shí)別病原菌Avr基因（Avirulence gene）后產(chǎn)生蛋白效應(yīng)子激發(fā)免疫反應(yīng)（Effectorstriggered immunity，ETI）[11]，限制大豆疫霉侵染。另一方面，植物產(chǎn)生與抗病性有關(guān)生理活性物質(zhì)，由病原菌侵染誘導(dǎo)產(chǎn)生，如β-1,3葡聚糖酶[12]等，或植物固有木栓質(zhì)[13]等。

目前，Rps基因定位和鑒定拓展大豆疫霉誘導(dǎo)性抗病機(jī)制研究[14]，關(guān)于固有抗病性機(jī)理研究有限。種子分泌物作為寄主植物固有抗病性是抗病過程重要部分，本試驗(yàn)選用大豆疫霉抗病品種Williams82和感病品種Sloan，測(cè)定其種子分泌物對(duì)大豆疫霉發(fā)育行為的影響，分析大豆種子分泌物與品種抗病性關(guān)系，為了解大豆抗病品種種子分泌物在大豆抗疫霉根腐病中作用，有效控制該病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株Eps597-3，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供，致病型為1a,3c,7。

供試大豆品種：感病品種Sloan，不含任何已知抗大豆疫霉根腐病基因，可被大豆疫霉任何生理小種侵染；抗病品種Williams82，對(duì)供試菌株Eps597-3表現(xiàn)抗??；以上2個(gè)品種均由Dr.Sung M.Lim（University of Arkansas）惠贈(zèng)。

供試培養(yǎng)基：胡蘿卜瓊脂（Carrot agar，CA）培養(yǎng)基，稱取200 g新鮮胡蘿卜，加少量無菌蒸餾水，組織搗碎機(jī)攪碎，四層紗布過濾，濾液中加20 g瓊脂粉，煮沸熔化，加無菌蒸餾水補(bǔ)至1 000 mL，分裝，121℃高壓滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 大豆種子分泌物收集

分別稱取籽粒飽滿、尺寸均勻抗感品種大豆種子20 g，75%酒精消毒1 min，超純水漂洗3次，放在無菌培養(yǎng)皿（d=10 cm）中，加入20 mL超純水，置于黑暗條件下25℃恒溫培養(yǎng)，24 h后種子吸水膨脹釋放種子分泌物，補(bǔ)充超純水至20 mL。48 h后收集種子分泌物，收集濃度為1 g種子鮮重對(duì)應(yīng)1 mL超純水，孔徑為0.22 μm一次性細(xì)菌濾器過濾，分裝置于-80℃冰箱保存。試驗(yàn)所用種子分泌物終濃度均為20%收集濃度。

1.2.2 大豆種子分泌物對(duì)大豆疫霉菌絲生長及卵孢子形成的影響

將保存的Eps597-3菌株轉(zhuǎn)移至胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基活化4～5 d，取抗、感病大豆種子分泌物溶液分別與胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基混合后倒平板（d=5 cm），打孔器選取長勢(shì)一致大豆疫霉菌餅轉(zhuǎn)移至平板中央，黑暗條件25℃恒溫培養(yǎng)，每隔12 h測(cè)定菌落直徑，以加等量超純水胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基為空白對(duì)照，評(píng)價(jià)不同品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉菌絲生長的影響（參照文獻(xiàn)[15]方法，稍作改進(jìn)）。分別于第5、7及10天在每個(gè)處理相同位置選取3個(gè)菌碟，顯微鏡下觀察記錄卵孢子數(shù)量，每個(gè)菌碟100×顯微鏡下觀察3個(gè)視野，記錄各處理下卵孢子形成情況。每個(gè)處理3次重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 大豆種子分泌物對(duì)大豆疫霉卵孢子萌發(fā)的影響

大豆疫霉卵孢子懸浮液制備：將保存的Eps 597-3菌株轉(zhuǎn)移至胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d，從平板上切取含大量卵孢子的瓊脂塊，加超純水50 mL，組織搗碎勻漿機(jī)（5 000 r·min-1）勻漿2 min，勻漿液經(jīng)4層紗布過濾獲得卵孢子懸浮液，將卵子懸浮液配制成適當(dāng)濃度備用（參照文獻(xiàn)[16]方法）。

取卵孢子懸浮液和抗、感病大豆種子分泌物溶液加入離心管中，充分混合后置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，以加等量超純水代替種子分泌物為空白對(duì)照，分別于5、7及10 d觀察各處理卵孢子萌發(fā)情況，每個(gè)處理隨機(jī)選取200個(gè)卵孢子，計(jì)算萌發(fā)率。每個(gè)處理3次重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 大豆種子分泌物對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性的影響

大豆疫霉游動(dòng)孢子懸浮液制備：將保存的Eps597-3菌株轉(zhuǎn)移至胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基上活化4～5 d，打孔器將菌落分割成直徑約1 cm菌餅，放入無菌培養(yǎng)皿中，加超純水至剛好超過菌餅表面。將培養(yǎng)皿置于20℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，期間每隔30 min換1次超純水促進(jìn)孢子囊產(chǎn)生。7～8 h后鏡檢孢子囊產(chǎn)生情況，待產(chǎn)生大量孢子囊后，置于4℃冰箱，40 min后取出，放至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上靜置2～3 h，即可產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子。移除菌餅，將游動(dòng)孢子懸浮液配制成適當(dāng)濃度備用。

在潔凈載玻片上相距3 cm位置粘兩條塑料片，兩條塑料片上蓋玻片，形成深度為3 mm空間。用移液槍向空間內(nèi)加入新鮮游動(dòng)孢子懸浮液（2×104個(gè)·mL-1），使其充滿全部空間。取2 μL抗、感病大豆種子分泌物溶液毛細(xì)管插入趨化性測(cè)定室一端3 mm，另一端插入2 μL超純水毛細(xì)管作對(duì)照（參照文獻(xiàn)[17]方法，稍作改進(jìn)）。分別記錄5、15及25 min時(shí)兩只毛細(xì)管游動(dòng)孢子數(shù)量，比較大豆疫霉游動(dòng)孢子對(duì)抗病和感病大豆品種種子分泌物趨化性差異。試驗(yàn)時(shí)室內(nèi)溫度25℃，每個(gè)處理重復(fù)3次，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 大豆種子分泌物對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊的影響

取2×104個(gè)·mL-1游動(dòng)孢子新鮮游動(dòng)孢子懸浮液加入離心管中，向離心管加入抗、感病大豆種子分泌物溶液，混合均勻。取混合液加入凹玻片凹槽內(nèi)，以加等量超純水代替種子分泌物為空白對(duì)照。將凹玻片放置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，分別記錄30 min、1 h及2 h時(shí)各處理游動(dòng)孢子成囊率。試驗(yàn)時(shí)室內(nèi)溫度25℃，每處理重復(fù)3次，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 大豆種子分泌物對(duì)大豆疫霉孢囊萌發(fā)的影響

取含有2×104個(gè)·mL-1新鮮游動(dòng)孢子懸浮液加入離心管中，10 000 r·min-1渦旋混合器中震蕩70 s即可使游動(dòng)孢子成囊。向游動(dòng)孢子懸浮液中加入抗、感病大豆種子分泌物溶液，混合均勻后置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上培養(yǎng)，以加等量超純水代替種子分泌物為空白對(duì)照，取混合液加入凹玻片凹槽內(nèi)，分別記錄8、9及10 h時(shí)各處理孢囊萌發(fā)率。試驗(yàn)時(shí)室內(nèi)溫度25℃，每個(gè)處理重復(fù)3次，3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉菌絲生長的影響

大豆疫霉菌絲72～96 h時(shí)生長速率最快，120 h時(shí)充滿玻璃皿（d=5 cm）。感病品種Sloan種子分泌物促進(jìn)大豆疫霉菌絲生長，抗病品種Williams82種子分泌物抑制大豆疫霉菌絲生長（見圖1A）。隨時(shí)間推移，感病品種Sloan種子分泌物促進(jìn)作用逐漸減小，而抗病品種Williams82種子分泌物抑制作用逐漸增強(qiáng)，但與空白對(duì)照相比，均未達(dá)顯著差異，因此認(rèn)為抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉菌絲生長無顯著影響（見表1）。

2.2 抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉卵孢子形成的影響

與對(duì)照相比，抗、感大豆品種種子分泌物均顯著促進(jìn)卵孢子形成。接種后5 d內(nèi)感病品種Sloan種子分泌物處理卵孢子形成速率顯著高于抗病品種Willams82（見圖2A）。7 d時(shí)，感病品種Sloan種子分泌物處理卵孢子平均數(shù)量為297.3個(gè)，抗病品種Williams82為219個(gè)，對(duì)照處理為147.7個(gè)（見圖1B）。隨時(shí)間推移，抗、感品種種子分泌物處理間卵孢子數(shù)量差距逐漸縮小，但仍均顯著高于對(duì)照，10 d時(shí)，感病品種Sloan種子分泌物處理卵孢子平均數(shù)量為427個(gè)，抗病品種Williams82為377個(gè)，超純水對(duì)照處理為242個(gè)。

2.3 抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉卵孢子萌發(fā)的影響

抗、感大豆品種種子分泌物處理卵孢子萌發(fā)率均顯著高于對(duì)照，感病品種Sloan種子分泌物處理卵孢子萌發(fā)率顯著高于抗病品種Williams82（見圖2B）。

隨時(shí)間推移，各處理卵孢子萌發(fā)率逐漸增加。7 d時(shí)，感病品種Sloan種子分泌物處理卵孢子萌發(fā)率為43.05%，抗病品種Williams82為30.59%，超純水對(duì)照處理為20.94%（見圖1C）。

圖1 抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉菌絲生長、卵孢子形成及萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of seed exudates of resistant and susceptible soybean cultivars on Phytophthora sojae mycelial growth,oospores formation and germination

表1 抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉菌絲生長影響Table 1 Effect of seed exudates of resistant and susceptible soybean cultivars on mycelial growth of Phytophthora sojae

2.4 抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性的影響

與對(duì)照相比，抗、感大豆品種種子分泌物顯著吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子，其中感病品種Sloan種子分泌物吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子數(shù)量顯著高于抗病品種Williams82（見圖3）。分別測(cè)定接種后5、15和25 min時(shí)吸引游動(dòng)孢子數(shù)量，發(fā)現(xiàn)15 min時(shí)種子分泌物對(duì)游動(dòng)孢子吸引量達(dá)最高值，感病品種Sloan種子分泌物吸引游動(dòng)孢子平均為143.8個(gè)，抗病品種Williams82為58.2個(gè)，超純水對(duì)照處理為28.9個(gè)（見圖4A）。

2.5 抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊的影響

與對(duì)照相比，抗、感大豆品種種子分泌物顯著促進(jìn)大豆疫霉游動(dòng)孢子快速成囊，其中感病品種Sloan種子分泌物中游動(dòng)孢子成囊速度更快，成囊率顯著高于抗病品種Williams82（見圖5A）。與種子分泌物混合1 h后，感病品種Sloan種子分泌物中游動(dòng)孢子成囊率已達(dá)89.63%，抗病品種Williams82為52.08%，超純水對(duì)照處理為17.11%（見圖4B）；2 h時(shí)，成囊率依次為96.9%、89.39%和59.52%。

2.6 抗、感大豆品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢囊萌發(fā)的影響

抗、感大豆品種種子分泌物孢囊萌發(fā)率顯著高于超純水對(duì)照，其中，感病品種Sloan種子分泌物中孢囊萌發(fā)速率更快，萌發(fā)率顯著高于抗病品種Williams82（見圖5B）。各處理孢囊萌發(fā)率隨時(shí)間推移逐漸增加。10 h時(shí)，感病品種Sloan種子分泌物孢囊萌發(fā)率為96.75%，抗病品種Williams 82為62.58%，超純水對(duì)照處理為43.62%（見圖4C）。

圖3 毛細(xì)管中抗、感大豆品種種子分泌物吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子數(shù)量Fig.3 Number of Phytophthora sojae zoospores attractted by seed exudates of resistant and susceptible soybean cultivars in capillary tubes

圖4 抗、感大豆品種種子分泌物處理游動(dòng)孢子趨化性、成囊及孢囊萌發(fā)Fig.4 Chemotaxis,cysts formation and germination of Phytophthora sojae in seed exudates of resistant and susceptible soybean cultivars

圖5 抗、感大豆品種種子分泌物中大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊及孢囊萌發(fā)情況Fig.5 Phytophthora sojae cysts formation and germination in seed exudates of resistant and susceptible soybean cultivars

3 討論與結(jié)論

大豆疫霉通過游動(dòng)孢子尋找寄主，識(shí)別寄主是與寄主相互作用的第一步[18]?？?、感大豆品種種子分泌物均可有效吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子，但游動(dòng)孢子對(duì)感病品種種子分泌物趨化性更強(qiáng)，因其對(duì)種子分泌物中特異性或非特異性引誘劑具有高度敏感性，例如氨基酸[19]、異黃酮daidzein和genistein[20]等。不同大豆品種種子分泌物組分種類和含量差異較大，導(dǎo)致對(duì)游動(dòng)孢子吸引力差異。大豆疫霉可通過識(shí)別種子分泌物中寄主?；孕盘?hào)分子如異黃酮，選擇適合侵染的寄主[21]。此外，不同濃度種子分泌物對(duì)游動(dòng)孢子吸引力差異顯著，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)相對(duì)原位濃度下抗、感品種種子分泌物對(duì)游動(dòng)孢子吸引量均與對(duì)照無顯著差異，且游動(dòng)孢子吸引量隨種子分泌物稀釋倍數(shù)增加而增加，稀釋5倍（本試驗(yàn)終濃度）時(shí)游動(dòng)孢子吸引量最大，且抗、感品種間差異顯著，因?yàn)榉N子分泌物中某些組分在低濃度下吸引游動(dòng)孢子，高濃度下則對(duì)游動(dòng)孢子有驅(qū)避作用。

種子分泌物中蛋白質(zhì)、次生代謝物質(zhì)等也是一類有效分子防御物質(zhì)，可抑制病原菌活性從而阻止侵染[22]。大豆種子分泌物存在63種分泌蛋白，包括β-1,3葡聚糖酶、角素、外源凝集素、脂氧化酶等，均與植物防御有關(guān)[23]。此外，大豆種子分泌物中還含有大量胰蛋白酶抑制劑，可抑制植物病原菌蛋白活性[24]，起抗病作用。無論是抗病品種還是感病品種，均可被大豆疫霉侵染[25]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照相比，抗、感品種種子分泌物均可促進(jìn)大豆疫霉發(fā)育行為變化，促進(jìn)侵染，但是抗、感品種間差異顯著，與感病品種相比，抗病品種種子分泌物顯著抑制卵孢子形成及萌發(fā)，且孢囊萌發(fā)率明顯降低，說明不同品種種子分泌物影響大豆對(duì)大豆疫霉抗性，種子分泌物作為寄主抵御病原菌第一道防線，與抗病性程度密切相關(guān)。