李亞璞,麻云蓮,樊丹,張小兵
(1.河北省科學(xué)院生物研究所,河北石家莊 050081)(2.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300132)
近年來(lái)食品過敏性疾病的發(fā)病率呈持續(xù)快速上升的趨勢(shì),食品過敏原的種類和來(lái)源急劇增加,與食品過敏直接相關(guān)的過敏疾病亦趨于多樣化、復(fù)雜化的趨勢(shì)[1],食物過敏問題被認(rèn)為是一個(gè)不容忽視的食品安全問題[2]。常見的食物過敏反應(yīng)主要由八大類食物引起,包括牛奶、大豆、蛋類、花生、堅(jiān)果、小麥、魚蝦和水生貝殼類動(dòng)物,美國(guó)和歐盟已先后頒布了新的食品標(biāo)簽法規(guī),要求八大類過敏食品都應(yīng)在食品標(biāo)簽中明確標(biāo)示[3,4]。牛奶過敏是其中最重要的一個(gè)方面,牛奶過敏極大地影響了嬰幼兒的身體健康,可以引起嬰幼兒腹瀉、皮疹、發(fā)育不良,嚴(yán)重時(shí)可引起過敏性休克等。
導(dǎo)致牛奶過敏的蛋白質(zhì)主要有酪蛋白(CN)、β-乳球蛋白(β-Lg)、α-乳白蛋白(α-La)等,其中 β-Lg被認(rèn)為是其中重要的致敏蛋白質(zhì)之一[5]。β-Lg是牛乳中主要的蛋白質(zhì),在乳清蛋白中總含量達(dá)50%,占牛乳總蛋白的10%,它是由乳腺上皮細(xì)胞合成的牛乳特有蛋白,β-Lg單體的分子質(zhì)量大約為 18.3 ku,含有162個(gè)氨基酸殘基,等電點(diǎn)為5.3[6]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)食品中β-Lg的檢測(cè)方法主要有色譜法(HPLC)[7]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[8]以及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[9]等,由于ELISA方法具有高靈敏度、高通量、操作簡(jiǎn)單等方面的優(yōu)勢(shì),目前市場(chǎng)上出現(xiàn)的商業(yè)化試劑盒多以ELISA技術(shù)為主,而且多數(shù)都是進(jìn)口產(chǎn)品,價(jià)格昂貴,檢測(cè)成本較高,因此很有必要研制成本較低的檢測(cè)產(chǎn)品,以滿足國(guó)內(nèi)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的需要。因此,本研究以牛奶β-Lg為免疫原,制備其多克隆抗體和單克隆抗體,嘗試研制出能夠用來(lái)檢測(cè)β-Lg的ELISA試劑盒,以滿足國(guó)內(nèi)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的需要。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
免疫用BALB/c小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(冀)2013-1-003;免疫用新西蘭大白兔購(gòu)自鹿泉當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)。
1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、酪蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、雞卵清蛋白、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、甘油、吐溫-20均為Sigma公司產(chǎn)品;胎牛血清、DMEM均為Gibco公司產(chǎn)品;HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品,其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
洗板機(jī),Thermo;酶標(biāo)儀,Bio-TEK;37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,SANYO;超高速低溫離心機(jī),HITACHI;ND-2000核酸蛋白測(cè)定儀,Thermo;滅菌鍋,Panasonic;CO2培養(yǎng)箱,Edison;倒置顯微鏡,OLYMPUS。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 免疫抗原的制備
在天平上準(zhǔn)確稱取一定量β-Lg標(biāo)準(zhǔn)品,用超純水稀釋至1 mg/mL,然后將抗原液分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2 動(dòng)物免疫
用β-Lg抗原免疫新西蘭大白兔1只,免疫劑量400 μg/只,初次免疫用弗氏完全佐劑,每隔2周免疫1次,第二次免疫劑量不變,免疫佐劑換為弗氏不完全佐劑,三次免疫后耳緣靜脈取血,離心取上清初步測(cè)定抗血清效價(jià),接著繼續(xù)進(jìn)行免疫,直到血清效價(jià)沒有變化即可取血,離心所得上清即為抗β-Lg兔多克隆抗體。同上述方法免疫3只BALB/c小鼠,免疫劑量為40 μg/只,經(jīng)過三次免疫后斷尾取血,離心取上清測(cè)定小鼠血清效價(jià),選取效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫,劑量減半,準(zhǔn)備細(xì)胞融合。
1.4.3 血清效價(jià)測(cè)定
抗體效價(jià)表明有效抗體濃度,是抗體質(zhì)量的基本指標(biāo)。試驗(yàn)采用間接ELISA法進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定:用碳酸鹽緩沖液稀釋?duì)?Lg抗原至濃度為10 μg/mL,將抗原液100 μL/孔加入到酶標(biāo)板孔中,4 ℃包被過夜;取出包被板洗滌3次后每孔加入200 μL封閉液,37 ℃放置1 h;洗滌后加入抗血清100 μL,首孔抗血清以1:200倍稀釋,接著進(jìn)行倍比稀釋,連續(xù)稀釋23孔,并設(shè)空白對(duì)照,陰性對(duì)照血清處理同上,37 ℃放置45 min;洗滌后加入相應(yīng)酶標(biāo)二抗,37 ℃放置30 min;洗滌后加入底物顯色液 100 μL,37 ℃避光反應(yīng) 15 min;每孔加入50 μL H2SO4終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度OD450nm。結(jié)果判定:抗血清OD450nm值記為P,陰性對(duì)照OD450nm值記為N,以P/N≥2.1的血清稀釋倍數(shù)即為抗血清效價(jià)。上述實(shí)驗(yàn)所用主要液體中,ELISA洗液配方為含0.05%吐溫-20的生理鹽水溶液,封閉液為含1%明膠的洗液。
1.4.4 抗β-Lg單克隆抗體細(xì)胞株的建立
1.4.4.1 細(xì)胞融合
準(zhǔn)備細(xì)胞融合前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)所需各種液體放置于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)熱,然后將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞在50 mL無(wú)菌離心管內(nèi)進(jìn)行混合,充分混勻,離心,用手輕輕彈擊離心管底部的細(xì)胞,然后向其中加入 l mL PEG溶液,時(shí)間控制在1 min內(nèi),之后加入DMEM不完全培養(yǎng)基,離心,沉淀用HAT完全培養(yǎng)基重懸,然后將重懸液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的酶標(biāo)板中,最后將酶標(biāo)板置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
1.4.4.2 亞克隆篩選及單克隆抗體的制備
通過有限稀釋法對(duì)檢測(cè)較好并且為單克隆的陽(yáng)性孔進(jìn)行3~6次的亞克隆篩選,待檢測(cè)結(jié)果全陽(yáng)性時(shí)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞數(shù)目達(dá)到一定量后采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法制備單克隆抗體,向每只經(jīng)過處理的小鼠腹腔內(nèi)注射細(xì)胞,經(jīng)過一段時(shí)間后取腹水,離心棄脂肪,所得液體即為腹水單抗,并將腹水置于-20 ℃保存,同時(shí)還要進(jìn)行細(xì)胞建株及液氮保存工作。
1.4.5 抗體特性測(cè)定
1.4.5.1 多克隆抗體的特性測(cè)定
采用免疫印跡法對(duì)抗β-Lg多抗進(jìn)行鑒定,將β-Lg抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上,以抗β-Lg兔多抗為一抗,以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗,最后用DAB顯色。由于Protein A和Protein G對(duì)不同種屬及類型的免疫球蛋白有不同的親和力,因此應(yīng)根據(jù)所要純化的免疫球蛋白的種屬和類型選擇合適的純化方法,一般純化兔多克隆抗體需選用ProteinA的分離純化方法。首先采用飽和硫酸銨法對(duì)多抗血清進(jìn)行純化,然后再將所得上清液采用ProteinA柱進(jìn)一步純化,透析后所得液體即為純化多抗,用ND-2000測(cè)定純化抗體蛋白濃度。
采用間接ELISA法對(duì)純化多抗進(jìn)行特異性測(cè)定,分別以乳中其它主要蛋白CN、α-La和BSA以及其它主要過敏原蛋白如雞卵清蛋白、蝦原肌球蛋白、花生蛋白和大豆蛋白包被酶標(biāo)板,其它步驟同多克隆抗體效價(jià)測(cè)定,以確定純化多抗的特異性。
1.4.5.2 單克隆抗體的特性測(cè)定
單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定同血清效價(jià)測(cè)定,抗體亞型采用亞型測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定,具體方法如下:將β-LG抗原包板,包被濃度為10 μg/mL,將1A4、3A7、2B10 3株抗體分別用洗液按1:10000進(jìn)行稀釋,3C10抗體因?yàn)樾r(jià)比較低,按照1:2000進(jìn)行稀釋,將稀釋好的抗體加入到酶標(biāo)板孔中,每個(gè)抗體3個(gè)重復(fù),37 ℃反應(yīng)45 min;洗滌后加入分型抗體,分型抗體用洗液進(jìn)行稀釋,按照1:1000稀釋比例進(jìn)行稀釋,37 ℃反應(yīng)30 min;洗滌后加入HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG,稀釋液為加入10%小牛血清的洗液,按照1:10000進(jìn)行稀釋,37 ℃反應(yīng)30 min;再次洗滌后加入顯色液,37 ℃反應(yīng)10 min,H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀讀數(shù)。
單抗腹水采用辛酸-硫酸銨法[10]進(jìn)行純化,用ND-2000測(cè)定純化抗體蛋白濃度,單克隆抗體特異性測(cè)定同多克隆抗體測(cè)定方法。
1.4.6 雙抗體夾心 ELISA檢測(cè)方法的初步建立
雙抗體夾心 ELISA法是常用的檢測(cè)食品過敏原的方法之一[11]。首先用碳酸鹽緩沖液稀釋?duì)?Lg純化多抗至濃度為10 μg/mL包被過夜,倒掉包被液,洗滌后每孔加入200 μL封閉液,37 ℃孵育1 h,倒掉封閉液,加入待檢測(cè)樣品,每孔加100 μL,陰性對(duì)照孔用PBS代替,37 ℃反應(yīng)1 h,洗滌后再加入按1:10000比例稀釋的3A7純化單抗,每孔加入100 μL,37 ℃反應(yīng)45 min,再次洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG,每孔加100 μL,37 ℃反應(yīng)30 min,經(jīng)過洗滌后加入顯色底物液,37 ℃反應(yīng)10 min,H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀讀數(shù)。
將乳中主要蛋白以及其它主要過敏原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成一定濃度作為待檢樣品,并對(duì)這些樣品進(jìn)行編號(hào),利用所建立的檢測(cè)方法對(duì)這些樣品進(jìn)行測(cè)定,依據(jù)顯色情況及測(cè)定數(shù)值判斷所檢測(cè)樣品中是否含有β-Lg,同時(shí)用色譜法進(jìn)行驗(yàn)證。
2.1 多克隆抗體測(cè)定結(jié)果
2.1.1 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果
采用間接ELISA法進(jìn)行多克隆抗體效價(jià)測(cè)定,測(cè)定結(jié)果如表1所示,依據(jù)血清效價(jià)的判定方法可知,經(jīng)過三次免疫后,β-Lg兔多抗血清效價(jià)很高,已達(dá)到1:3.28×106,第四次免疫后,效價(jià)有所提高,達(dá)到了1:6.56×106,而第五次免疫后效價(jià)不再有變化。抗血清的效價(jià)隨著免疫次數(shù)增加而提高,經(jīng)過幾次加強(qiáng)免疫后,血清效價(jià)就會(huì)達(dá)到一個(gè)最高值而穩(wěn)定在某一水平。因此,新西蘭大白兔經(jīng)過5次免疫后取血,離心后得到35 mL多抗血清。
表1 β-Lg兔多克隆抗體效價(jià)測(cè)定Table 1 The titers of the rabbit PcAb against β-Lactoglobulin
2.1.2 Western-blotting鑒定結(jié)果
圖1 抗β-Lg多克隆抗體的免疫印跡鑒定Fig.1 Western-blotting analysis of PcAb against β-lactoglobulin
Western-blotting鑒定結(jié)果如圖1所示,用兔抗牛奶過敏原β-Lg多克隆抗體與β-Lg抗原進(jìn)行免疫印跡,結(jié)果顯示該多抗能夠與β-Lg蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),大約在18.3 ku處有明顯的陽(yáng)性條帶出現(xiàn),條帶位置正確,說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)制備的兔多克隆抗體與 β-Lg免疫反應(yīng)良好。
2.1.3 兔多克隆抗體的純化及濃度測(cè)定
圖2 ProteinA親和純化色譜圖Fig.2 The affinity chromatography of PcAb
將兔多抗血清首先經(jīng)過飽和硫酸銨純化,再經(jīng)Protein A柱進(jìn)一步純化,Protein A純化過程如圖2所示,首先將ProteinA柱平衡,然后用0.01 mol/L PBS將待純化血清稀釋后進(jìn)行上樣,峰1為雜蛋白,然后將上樣緩沖液換成洗脫緩沖液,峰2為洗脫出的特異性蛋白,即目標(biāo)蛋白。
由于峰2峰尖較尖,峰形較好,初步說(shuō)明該抗體的純化效果較好。洗脫完畢后換成清洗緩沖液以洗脫少量頑固結(jié)合的雜蛋白。將目標(biāo)蛋白再用0.01 mol/L PBS液進(jìn)行透析,透析后的液體即為純化的兔多抗,用ND-2000測(cè)定抗體蛋白濃度為2.07 mg/mL,然后將透析液進(jìn)行分裝,備用。
2.1.4 純化多抗的特異性測(cè)定
圖3 純化多抗特異性測(cè)定Fig.3 The detection of the specificity of the purified PcAb
交叉反應(yīng)的測(cè)定是用來(lái)表征抗體與不同結(jié)構(gòu)抗原發(fā)生結(jié)合的能力,同時(shí)也是衡量抗體特異性的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,將乳中主要交叉蛋白以及主要過敏原蛋白包被酶標(biāo)板,包被濃度均為 10 μg/mL,測(cè)定結(jié)果如圖 3所示,該純化多抗僅與 CN有一定的交叉反應(yīng),而與乳中其它蛋白以及主要過敏原蛋白完全沒有交叉反應(yīng),因此該多抗具有一定的特異性。
2.2 單克隆抗體測(cè)定結(jié)果
經(jīng)過三次免疫,測(cè)定 3#小鼠血清效價(jià)為1:8.20×105,1#和 2#小鼠血清效價(jià)為 1:4.10×105,因此挑選3#小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合后7 d觀察細(xì)胞培養(yǎng)板,6塊細(xì)胞培養(yǎng)板共計(jì)有576孔,其中有518孔有雜交瘤細(xì)胞形成,融合率為 90%。用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液,選其中OD450nm值較高的10孔進(jìn)行亞克隆篩選,然后進(jìn)行了擴(kuò)大培養(yǎng)。在擴(kuò)大培養(yǎng)的過程中通過測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清又進(jìn)行了特異性篩選,最后得到了4株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體而特異性較好的細(xì)胞株,分別為1A4、3A7、2B10和3C10,然后對(duì)這些抗體進(jìn)行了效價(jià)等特異性測(cè)定。
2.2.1 單抗細(xì)胞株效價(jià)測(cè)定結(jié)果
實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備腹水,每株抗體大約都獲得了10 mL的腹水抗體。采用間接ELISA法測(cè)定單抗細(xì)胞株效價(jià),測(cè)定結(jié)果如表2,除3C10抗體外,其余3株抗體效價(jià)均在106以上,較之融合前小鼠血清效價(jià)有很大的提高,該抗體效價(jià)完全能夠滿足免疫分析的要求。
表2 單抗細(xì)胞株效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 2 The titers of the McAbs against β-Lactoglobulin
2.2.2 單抗亞型測(cè)定結(jié)果
圖4 抗體亞型測(cè)定Fig.4 The detection of the subclass of McAbs
將篩選得到的4株雜交瘤細(xì)胞制備的腹水抗體進(jìn)行亞型鑒定,測(cè)定結(jié)果如圖4所示,由測(cè)定結(jié)果可知,該4株抗體亞型均為IgG1型,只有3C10抗體對(duì)IgA亞類抗體有一定的反應(yīng)。因?yàn)閱慰箒喰褪沁x擇單抗純化方法的基礎(chǔ),辛酸-硫酸銨法主要用于IgG1和IgG2b亞類抗體的純化,而且這種方法對(duì)抗體的活性影響較小,產(chǎn)率較高,并且獲得抗體的純度也較高,因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)單抗的純化選擇辛酸-硫酸銨法。
2.2.3 純化單抗特異性測(cè)定結(jié)果
圖5 3A7抗體特異性測(cè)定Fig.5 The detection of the specificity of 3A7 McAb
本實(shí)驗(yàn)采用辛酸-硫酸銨法對(duì)其中效價(jià)最高的3A7抗體進(jìn)行了純化,純化后抗體蛋白濃度為 5.06 mg/mL,對(duì)這株純化抗體特異性測(cè)定結(jié)果如圖5所示,由圖可知,該純化抗體與β-Lg反應(yīng)的OD450nm值與其它蛋白反應(yīng)的 OD450nm值相比有明顯的差異,說(shuō)明該純化單抗特異性很好,與乳中其它相關(guān)蛋白及主要過敏原蛋白基本無(wú)交叉反應(yīng),特異性優(yōu)于多克隆抗體。
2.3 樣品的初步檢測(cè)
利用所建立的雙抗體夾心 ELISA檢測(cè)方法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表3所示,只有3#檢測(cè)孔變?yōu)辄S色,該孔P/N值為19.51,判為陽(yáng)性;而其余孔沒有任何顏色變化,P/N值均在1左右,說(shuō)明這些樣品與陰性對(duì)照接近,判為陰性;同時(shí)將這些樣品用色譜法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示只有3#樣品含有β-Lg,兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致,因此該實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法可以定性的檢測(cè)樣品中的β-Lg。
表3 樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 The test results of samples
3.1 ELISA法是檢測(cè)食品過敏原常用的方法之一,它是利用酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合,即可保持酶催化反應(yīng)的敏感性,又保持了抗原抗體反應(yīng)的特異性[12]。酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確度取決于所用抗體的效價(jià)和特異性,因此制備高效價(jià)、高特異性的抗體是建立ELISA檢測(cè)方法的關(guān)鍵因素。因?yàn)閱慰寺】贵w具有較好的特異性,而多克隆抗體具有較高的靈敏度,這二者的結(jié)合所建立的雙抗體夾心 ELISA法就可以將食品中的微量物質(zhì)檢測(cè)出來(lái)。
3.2 目前,ELISA法用于牛奶過敏原的檢測(cè)主要集中在對(duì)牛奶蛋白全組分以及CN單一組分方面的研究,而對(duì) β-Lg單組分的研究還比較少。高淑霞[13]通過將β-Lg抗原分別免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠制備了兔多克隆抗體和鼠多克隆抗體,并建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。李欣等[14]通過純化水牛乳的β-Lg,制備了抗水牛乳β-Lg的兔多克隆抗體,并通過實(shí)驗(yàn)證明所制備的兔多克隆抗體與牛乳中主要蛋白都存在交叉反應(yīng),這可能是由免疫抗原純度造成的。本實(shí)驗(yàn)為了得到特異性較好的抗體,所用抗原為 β-Lg的標(biāo)準(zhǔn)品。
3.3 本實(shí)驗(yàn)將 β-Lg抗原免疫新西蘭大白兔制備了抗β-Lg多克隆抗體,所制備的多抗血清效價(jià)高達(dá)1:6.56×106,通過特異性測(cè)定結(jié)果及 Western-blotting鑒定結(jié)果可知,該多抗具有較好的特異性,僅與 CN具有一定的交叉反應(yīng)。在單克隆抗體的制備過程中,細(xì)胞融合是最關(guān)鍵的步驟,而影響細(xì)胞融合效果的因素有很多,如SP2/0細(xì)胞和脾細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和融合比例、PEG的用量以及PEG的作用時(shí)間等等,通過對(duì)以上幾個(gè)方面的控制,本次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞融合率高達(dá)90%。在細(xì)胞亞克隆篩選的過程中,通過對(duì)細(xì)胞上清特異性的測(cè)定,最后篩選得到了 4株特異性好的抗β-Lg單克隆抗體細(xì)胞株,從而保證了腹水抗體的特異性。實(shí)驗(yàn)選擇了其中效價(jià)最高的3A7抗體進(jìn)行了辛酸-硫酸銨純化,特異性測(cè)定結(jié)果顯示該純化抗體與乳中其它蛋白以及主要過敏原蛋白沒有任何交叉反應(yīng),特異性很好。利用所建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法對(duì)一些蛋白樣品進(jìn)行了定性測(cè)定,并且用色譜法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,兩者的符合率為 100%。目前本工作所得的抗 β-Lg單克隆抗體和多克隆抗體是建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的基礎(chǔ),若要進(jìn)一步應(yīng)用其建立雙抗體夾心的ELISA定量檢測(cè)方法,還需從反應(yīng)體系組成、反應(yīng)條件等方面進(jìn)行深入的研究。