馮濤，曾小蘭，張鈺，Marcelo Carignano，Osvaldo Campanella，李曉璽

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程，上海 201418）(2.卡塔爾環(huán)境與能源研究所，多哈 5825)

（3.普度大學(xué)食品科學(xué)系惠斯特勒碳水化合物研究中心，美國印第安納州 47907）

（4.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

姜黃素（curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃（Curcum a longa L）根莖中提取的一種酚類色素，是有效的藥物單體[1]。姜黃素分子對環(huán)境條件敏感，如對光、氧、熱敏感。姜黃素表現(xiàn)出極低的水溶性，穩(wěn)定性低，代謝快，吸收性差，這些特點嚴(yán)重降低了它的生物利用率，從而影響了它的健康功效[2]。

淀粉是豐富，廉價，天然可再生和可生物降解的多糖[2]。不同來源的淀粉具有直鏈淀粉和支鏈淀粉的差異，其在許多物理性質(zhì)上顯著不同[3,4]。一般情況下，B類型的淀粉具有長的支鏈淀粉，A類型的淀粉具有大量聚合度為6~12的短鏈[5]。短鏈葡聚糖是一種低分子量的親水性線性聚合物，其聚合度約為20，是由支鏈淀粉通過酶解脫支制備而得[6]。短鏈葡聚糖可以用作控釋的疏水性功能物質(zhì)的納米載體，來保持疏水性物質(zhì)的水溶性、生物活性等。支鏈淀粉經(jīng)酶解脫支，形成具有一定聚合度的線性直鏈淀粉短鏈，線性短鏈通過兩兩碰撞、纏繞并形成雙螺旋分子，使支鏈淀粉的消化性降低，改善了天然淀粉作為壁材輸送生物活性物質(zhì)易被人體胃腸道中酸和酶侵蝕的缺點。

為了提高姜黃素的水溶性，提高其在人體胃腸道中的吸收率，本研究擬采用蠟質(zhì)玉米淀粉為原材料。淀粉聚合物由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，需要酶（內(nèi)切酶和外消旋酶）的組合用于將淀粉解聚成寡糖和較小的糖，或者通過產(chǎn)生新的鍵（脫支酶和糖基轉(zhuǎn)移酶）轉(zhuǎn)移低聚葡萄糖苷鍵和殘基來轉(zhuǎn)化淀粉[2]。通過普魯蘭酶制備得到了短鏈葡聚糖，后利用溶液混合法制備了短鏈葡聚糖-姜黃素包合物，其載藥量和包埋率分別為28.46%和1.27%。初步實驗探究證明短鏈葡聚糖-姜黃素包合物的溶解性高于單獨的姜黃素水溶液，隨著包合物粒徑的減小，包埋率也提高了，考慮將短鏈葡聚糖-姜黃素包合物制備成納米乳液以提高芯材的包埋率和載藥量，從而提高其生物利用率。并利用分子動力學(xué)模擬的方法來分析短鏈葡聚糖與姜黃素包合機(jī)制。雖然短鏈葡聚糖-姜黃素水溶性納米粒子體系已經(jīng)在實驗室進(jìn)行研究，但是在分子水平上對其形成機(jī)理的研究還很少。

分子模擬是目前常用的一種對分子行為進(jìn)行解釋或預(yù)測的研究方法，廣泛地應(yīng)用于各學(xué)科領(lǐng)域[7]。YinZhang[8]報告了開發(fā)支鏈共價結(jié)構(gòu)和動態(tài)構(gòu)象多重性方法的應(yīng)用，其結(jié)合分子動力學(xué)（MD）模擬和鑭系元素輔助順磁性NMR光譜，以評估動態(tài)支鏈寡糖的構(gòu)象組合。M Umemura等[9]在分子動力學(xué)模擬的水溶液中麥芽糖和低聚果糖的糖苷鍵的水合對構(gòu)象柔性的影響，已經(jīng)在二千個TIP3P水分子中進(jìn)行了從單體到六聚體的麥芽糖和纖維寡糖的分子動力學(xué)模擬。麥芽糖和大麥低聚糖均由d-吡喃葡萄糖組成，但在其糖苷鍵具有不同的構(gòu)象柔性；后者比前者更僵硬。本文的目的是調(diào)查糖苷鍵上的構(gòu)象柔性對水溶液中水合狀態(tài)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

蠟質(zhì)玉米淀粉（食品級），國民淀粉；普魯蘭酶（E.C.3.2.1.41，6000 APU/g，1.15 g/mL，其中ASPU定義為在pH 4.4和60 ℃下1 min內(nèi)從淀粉中釋放出1.0 mg葡萄糖的酶量），一水合檸檬酸（分析純），上海國藥集團(tuán)；磷酸氫二鈉（分析純），上海國藥集團(tuán)；無水乙醇（分析純），上海國藥集團(tuán)；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純），Sigma試劑（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 短鏈葡聚糖的制備

短鏈葡聚糖的制備可參見Sun（2014）[10]。分別稱取一定量的蠟質(zhì)玉米淀粉，分別加入200 mL緩沖液（pH=5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液），配制成濃度為10%、15%、20%、25%（W/V）的淀粉漿。沸水浴并劇烈地攪拌30 min以充分糊化，降溫至58 ℃，分別加入一定量的普魯蘭酶(添加量是30 APU/g)，攪拌保溫8 h，快速離心（10000×g 2 min），取上清液。100 ℃加熱30 min以滅酶，4 ℃保持8 h，冷凍12 h；冷凍干燥48 h，即得短鏈葡聚糖。由濃度10%、15%、20%、25%的淀粉液制備的短鏈葡聚糖分別記為SC1、SC2、SC3、SC4。

1.2.2 短鏈葡聚糖-姜黃素包合物的制備

稱取一定量的姜黃素，配成4 mg/mL的姜黃素乙醇溶液。稱取一定量SC2，配成5 mg/mL的短鏈葡聚糖水溶液，超聲15 min，80 ℃水浴30 min。姜黃素緩慢加入到糊化后的短鏈葡聚糖溶液中，姜黃素與短鏈葡聚糖的重量百分比分別為1 wt%、2 wt%、3 wt%、4 wt%。加熱攪拌30 min，38 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min除去乙醇。高剪切分散乳化機(jī)（19000×g 5 min）。冷凍24 h，真空冷凍干燥48 h，即得短鏈葡聚糖-姜黃素包合物。

1.2.3 包埋率和載藥量的測定

包埋率EE(%)=(1-樣品中游離姜黃素/樣品中姜黃素總量)×100

載藥量LC(%)=(樣品中姜黃素的總量/樣品中短鏈葡聚糖的總量)×100

1.2.4 短鏈葡聚糖-姜黃素分子動力學(xué)模擬過程

短鏈葡聚糖是由Gregor博士提供的 V-型直鏈淀粉分子模型[11]截取而得的，是由 17個葡萄糖殘基組成的。姜黃素的prep文件來自Berhanu[12]等的補(bǔ)充信息。利用 AMBER14程序包實現(xiàn)的，采用了GLYCAM-06力場。短鏈葡聚糖和姜黃素作為溶質(zhì)都溶于最小寬度為10 ?的水盒子，溶劑模型是TIP3P。能量最小化處理經(jīng)歷三個階段，接著整個體系達(dá)到平衡過程，最后是動力學(xué)的模擬，在NPT系統(tǒng)下，體系進(jìn)行了600 ns的模擬。在模擬中，調(diào)用了周期性邊界條件。整個體系的截斷半徑設(shè)為10 ?。同時，還采用了SHAKE法則來限制氫原子，因此步長設(shè)為2 fs。對于軌跡，采取了每隔1 ps保存一幀的做法。在本文中，所有的圖都是由VMD及grace完成的。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗利用 AMBER 14程序包實現(xiàn)分子動力學(xué)模擬計算的，短鏈葡聚糖采用了GLYCAM-06力場，姜黃素選用的是GAFF力場。實驗利用Origin軟件進(jìn)行作圖，采用SPSS 18.0中ANOVA模塊對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 短鏈葡聚糖-姜黃素、載藥量

表1 短鏈葡聚糖-姜黃素包合物樣品的包埋率、載藥量和粒徑Table 1 encapsulation efficiency and loading content of inclusion complex and inclusion complexes

從表 1可知，姜黃素-短鏈葡聚糖包埋率最大為28.46%。Aditya[13]等以硬脂酸甘油酯、油酸和卵磷脂制備的油相體系為壁材，包埋姜黃素制得姜黃素包合物，所制得的包合物包埋率達(dá)到了（78±2）%，姜黃素的親脂特性和硬脂酸甘油酯的無序晶格結(jié)構(gòu)(有利于容納更多的客體分子)是所制得的包合物包埋率高的原因。從表1可以看出包埋率和載藥量最高時，包合物的粒徑是最小的，但卻高于1000 nm。

2.2 短鏈葡聚糖與姜黃素包埋過程

圖1 短鏈葡聚糖與姜黃素質(zhì)心之間的距離Fig.1 the COM (center of mass) distance between short glucan chain and curcumin

短鏈葡聚糖在600 ns內(nèi)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變快照圖及其與姜黃素的自組裝快照圖附件一和附件二。通過觀察發(fā)現(xiàn)，該模擬所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和初始狀態(tài)的結(jié)構(gòu)顯著不同。在模擬過程中，以近似V型直鏈淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)為短鏈葡聚糖的起始結(jié)構(gòu)。附件一未添加姜黃素的短鏈葡聚糖體系中可以看出，在第50 ns時，短鏈葡聚糖的螺旋結(jié)構(gòu)已經(jīng)伸展開，這可能是由于水分子與短鏈葡聚糖葡萄糖殘基上的O3和O2強(qiáng)烈作用破壞了分子內(nèi)氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[14]。從100 ns到600 ns，短鏈葡聚糖在水中的構(gòu)象為隨意的、無規(guī)律的無規(guī)卷曲構(gòu)象，這與López等[14]的結(jié)果一致。附件二添加姜黃素短鏈葡聚糖與姜黃素的自組裝快照圖。可以看出，0 ns時姜黃素分子位于SGC螺旋空腔外部；50 ns時SGC伸開，姜黃素分子與SGC纏繞在一起；接著在100 ns時，SGC與姜黃素分子再次分開；130 ns時，SGC與姜黃素分子仍處于分開的狀態(tài)，從圖中可以開出，姜黃素分子發(fā)生折疊；150 ns時，SGC與姜黃素分子重新纏繞在一起；200 ns時，姜黃素分子被包裹在短鏈葡聚糖尾部；250 ns時，SGC對姜黃素分子由環(huán)繞變成半纏繞；300 ns時，SGC與姜黃素分子纏繞位置及方式相似；310 ns，SGC與姜黃素再次分離，姜黃素分子在短鏈葡聚糖尾部折疊成V型結(jié)構(gòu)；350 ns時，SGC形成一個不在同一個平面上的不閉合圓環(huán)，姜黃素分子一半嵌入圓環(huán)內(nèi)，另外一半處于圓環(huán)外；370 ns時，姜黃素分子完全被SGC包裹；400 ns，姜黃素分子被纏繞在SGC的中部；從450 ns到550 ns，SGC將姜黃素分子包埋進(jìn)其空腔中；600 ns時，SGC半纏繞姜黃素分子。

從圖1可看出，短鏈葡聚糖與姜黃素分子質(zhì)心之間的距離處于動態(tài)的變化中，從0 ns到600 ns，兩者的距離呈現(xiàn)出先減小后增加的循環(huán)往復(fù)的變化直至最后減小且波動不大，這說明短鏈葡聚糖與姜黃素分子呈現(xiàn)出先包埋后解離的循環(huán)的構(gòu)象變化，最后又包埋直至比較穩(wěn)定的狀態(tài)，這也與短鏈葡聚糖自身構(gòu)象發(fā)生折疊和翻轉(zhuǎn)有一定的關(guān)系。這與附件二的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變快照圖所呈現(xiàn)的構(gòu)象變化一致。因此，我們可以得出短鏈葡聚糖與姜黃素分子形成的包合物前400 ns不是很穩(wěn)定，400 ns以后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.3 體系的回轉(zhuǎn)半徑

回轉(zhuǎn)半徑是直接反映復(fù)合物溶解特性的主要特征之一。在短鏈葡聚糖、姜黃素二元體系中，短鏈葡聚糖的回轉(zhuǎn)半徑可以分為兩個階段，在第一階段(0

圖2 體系中短鏈葡聚糖的回轉(zhuǎn)半徑Fig.2 Radius of gyration (Rg) of short glucan chains

2.4 分子間相互作用

圖3 體系中溶質(zhì)與溶劑之間的氫鍵數(shù)量及溶質(zhì)-溶劑-溶質(zhì)的鹽橋數(shù)量Fig.3 The number of hydrogen bonds and salt bridges of curcumin aqueous solution

為了研究短鏈葡聚糖與姜黃素之間的分子間相互作用，分析了體系氫鍵和鹽橋的變化。氫鍵是分子體系中一種重要的非共價結(jié)構(gòu)力，氫鍵第一次被描述出來是在 1992年[16]。氫鍵的判據(jù)設(shè)定為氫鍵供體與受體的距離小于3.5 ?，角度小于135°，而鹽橋的判據(jù)也設(shè)定為供體與受體的距離小于3.5 ?。從圖3a可以看出，600 ns間未添加姜黃素和添加姜黃素的短鏈葡聚糖體系中溶質(zhì)-溶劑分子間氫鍵的總數(shù)量都在不斷的變化，在此過程中，不斷有氫鍵斷裂和新的氫鍵形成，兩者差值的絕對值即為此刻的氫鍵數(shù)量。從圖 3可以看出未添加姜黃素的體系中溶質(zhì)-溶劑分子間氫鍵數(shù)量大部分時間保持在60以下，而添加了姜黃素的體系中溶質(zhì)-溶劑氫鍵數(shù)量在60左右平穩(wěn)的振動，這說明添加了姜黃素分子的體系中溶質(zhì)-溶劑的氫鍵數(shù)量比未添加姜黃素的體系中氫鍵數(shù)量多，姜黃素對短鏈葡聚糖的構(gòu)象有一定的作用。

氫鍵的供體和受體無論是在溶液（他們和周圍的水形成氫鍵）中還是在活性位點（他們和受體殘基形成氫鍵）都很容易形成[17]。表2給出了未添加姜黃素分子的體系中短鏈葡聚糖分子內(nèi)形成的氫鍵，其中表中的 nGA (n=0, 4)表示短鏈葡聚糖上的葡萄糖殘基(n=0表示短鏈葡聚糖上一端的葡萄糖殘基，n=4表示短鏈葡聚糖上中間的葡萄糖殘基)。nGA后的數(shù)字表示殘基序號，@符號后的H3O及O2分別是在力場中氫原子和氧原子的名稱，體系模擬了600 ns，下同。從表2中可以看出氫鍵占有比例最高的是短鏈葡聚糖中第十二個葡萄糖殘基上的 H3O氫原子與短鏈葡聚糖中第十三個葡萄糖殘基上的O2氧原子形成的氫鍵，為8.63%，該氫鍵僅存在了51780幀，即在600 ns中僅存在了51.78 ns，說明該氫鍵不穩(wěn)定。因此未添加姜黃素分子的體系中短鏈葡聚糖分子間形成的氫鍵不穩(wěn)定。

表3給出了添加姜黃素分子的體系中短鏈葡聚糖分子內(nèi)形成的氫鍵，可以看出，氫鍵占有比例最高的是短鏈葡聚糖中第九個葡萄糖殘基上的 H3O氫原子與短鏈葡聚糖中第十個葡萄糖殘基上的O2氧原子形成的氫鍵，為31.90%。其中在未添加姜黃素分子的體系中出現(xiàn)的占有比例最高的氫鍵在此體系中仍然存在，占有比例變?yōu)?4.72%，說明了該氫鍵在添加了姜黃素的短鏈葡聚糖水溶液體系中比未添加姜黃素的體系中穩(wěn)定。其中，通過對比發(fā)現(xiàn)，未添加姜黃素體系中短鏈葡聚糖分子內(nèi)形成的氫鍵占有比例在10%以上的沒有，而添加了姜黃素的體系中占有比例在10%以上的氫鍵個數(shù)為11個，這說明在添加了姜黃素的體系中，短鏈葡聚糖分子內(nèi)氫鍵個數(shù)增加，氫鍵穩(wěn)定性增強(qiáng)。

表4給出了短鏈葡聚糖與姜黃素分子之間形成的氫鍵，從表4中可以看出，占有比例最高的是短鏈葡聚糖上第六個葡萄糖殘基上的 H3O氫原子與姜黃素分子上的O33氧原子，占有比例為6.42%，出現(xiàn)的幀數(shù)為38540，即在600 ns的模擬過程中有38.54 ns出現(xiàn)該氫鍵。

由圖1中0~600 ns結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變構(gòu)象圖可知，短鏈葡聚糖與姜黃素的包埋處于動態(tài)過程中，即包埋和解離相互交替，又由于氫鍵是根據(jù)簡單的氫供體原子和受體原子之間的距離及供體-氫-受體角度的幾何標(biāo)準(zhǔn)來判定，因此當(dāng)短鏈葡聚糖與姜黃素包合物解離并相互遠(yuǎn)離時，該氫鍵發(fā)生斷裂，當(dāng)兩者再次靠近時，該氫鍵重新形成。所以該氫鍵出現(xiàn)的38.54 ns很可能是在短鏈葡聚糖與姜黃素包埋過程中出現(xiàn)的。

表2 未添加姜黃素分子的體系中短鏈葡聚糖分子內(nèi)形成的氫鍵Table 2 The hydrogen bonds formed in the short glucan chain molecules in the system without the addition of curcumin molecules

表3 添加姜黃素分子的體系中短鏈葡聚糖分子內(nèi)形成的氫鍵Table 3 The hydrogen bonds formed in the short glucan chain molecule in the system of adding curcumin molecules

表4 添加姜黃素分子的體系中短鏈葡聚糖與姜黃素分子間形成的氫鍵Table 4 The hydrogen bonds formed between the short glucan chain and the curcumin molecule in the system of adding curcumin molecules

3 結(jié)論

本文利用Amber軟件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，研究了短鏈葡聚糖-姜黃素體系包埋過程的自組裝機(jī)制。發(fā)現(xiàn)短葡聚糖鏈與姜黃素分子包埋處于包埋和解離的動態(tài)過程中，即包埋和解離交替進(jìn)行最終達(dá)到一個相對穩(wěn)定的包結(jié)狀態(tài)。從分子模擬的角度發(fā)現(xiàn)不僅姜黃素的存在影響了短鏈葡聚糖的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，姜黃素分子體系中短鏈葡聚糖分子內(nèi)形成的氫鍵，姜黃素分子的體系中短鏈葡聚糖與姜黃素分子間形成的氫鍵的數(shù)量及穩(wěn)定性分別都大于短鏈葡聚糖水溶液體系中氫鍵的數(shù)量及穩(wěn)定性，這說明姜黃素的存在增加了短鏈葡聚糖的水合作用，在一定程度上提高了姜黃素的溶解度，為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開發(fā)新型壁材提供理論依據(jù)。