呂博，李明達，張毅方，牛祥臣，王中江，江連洲，劉軍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）（2.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東禹城 251200）

拉曼光譜技術(shù)是一門基于拉曼散射效應(yīng)而發(fā)展起來的光譜分析技術(shù)，體現(xiàn)的是分子的振動或轉(zhuǎn)動信息。拉曼光譜技術(shù)與常規(guī)化學分析技術(shù)相比，具有無損、快速、環(huán)保、無需制備試樣、無需消耗化學試劑和所需樣品量少等特點，并且激光光源的出現(xiàn)使得拉曼光譜已廣泛應(yīng)用于石油化工、生物醫(yī)學、地質(zhì)考古、刑事司法和寶石鑒定等領(lǐng)域。目前研究蛋白構(gòu)象的方法較多，但是紅外光譜和拉曼光譜可以說是最常用的方法。眾所周知紅外光譜由于簡單實用，是最早也是應(yīng)用最普遍的研究蛋白構(gòu)象的方法；而拉曼光譜作為對紅外光譜的一個補充，由于其在樣品量稀少（如單絲）和有水干擾（如溶液或溶膠狀態(tài)）等情況下具有紅外光譜無法比擬的優(yōu)勢，因此它也是一個非常有用的研究蛋白構(gòu)象的方法。與其他光譜儀器技術(shù)相比，拉曼光譜是一種既能提供蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)信息[1～3]又具有非破壞性的直接分析技術(shù)[4]。從蛋白質(zhì)的拉曼光譜可以得到有關(guān)它的芳香族組成氨基酸的信息，還能進一步得到二級結(jié)構(gòu)的信息。有關(guān)利用拉曼光譜分析多肽及蛋白質(zhì)構(gòu)型的研究國內(nèi)外均有報道[5～7]。大豆分離蛋白由于其豐富的營養(yǎng)價值，在食品加工中應(yīng)用廣泛。目前對蛋白質(zhì)改性的方法主要有物理改性、化學改性和酶法改性。高壓均質(zhì)是最常用、也是最被廣為接受的改性手段。原理是通過利用高壓均質(zhì)產(chǎn)生的強大剪切力、沖擊力、撞擊力，改變蛋白質(zhì)固有的結(jié)構(gòu)，改變其功能特性，以提高蛋白質(zhì)的應(yīng)用價值[8]。但是大部分學者研究的壓力范圍都是在40 MPa以上。Puppo等[9]研究了超過100 MPa高壓均質(zhì)對大豆蛋白質(zhì)的影響，已經(jīng)證明高壓均質(zhì)對大多數(shù)球蛋白的三級和四級結(jié)構(gòu)有破壞性影響，而對二級結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響。沈蘭[10]等研究發(fā)現(xiàn)0～160 MPa高壓微射流處理可以使蛋白分子展開，使蛋白發(fā)生部分變性，但是對于蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。張媛[11]研究發(fā)現(xiàn)60～120 MPa的高壓均質(zhì)對大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角含量增多，β-折疊含量減少，無規(guī)則卷曲含量亦發(fā)生變化。

在實際生產(chǎn)中，由于設(shè)備的限制，高壓均質(zhì)的壓力一般不超過40 MPa，本文對經(jīng)40 MPa以下均質(zhì)壓力處理后的大豆分離蛋白進行了拉曼光譜分析，并對其主要的碳鏈與側(cè)鏈構(gòu)象進行研究，從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征的變化探討其機理，希望能夠為大豆分離蛋白的實際生產(chǎn)提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 原料

低溫豆粕，山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

FD-1C冷凍干燥機，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；高速分散均質(zhì)機（FJ-200），上海標本模型廠；低速自動平衡離心機DT5-2，北京時代北利離心機公司；DFS-Dairy-001均質(zhì)機，帝斯曼公司；LGR20-W臺式高速冷凍離心機，北京京立離心機公司；PE Raman Station 400激光顯微拉曼光譜儀，美國PE公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

稱取1600 g低溫脫脂豆粕，分散在12 L去離子水中，用2 mol/L的NaoH調(diào)pH值至7.5，在55 ℃下攪拌1 h，離心（4500 r/min，20 min）取上清液；在沉淀中加入9.6 L去離子水攪拌并重復(fù)上述離心操作，取上清液[12]。將兩次上清液合并，在水浴 50 ℃下，調(diào)pH值至4.5，離心（3000 r/min，10 min）取沉淀，即為蛋白凝乳，加少量水洗滌3次后調(diào)pH值至7.0，配成11%的大豆分離蛋白溶液，分為9份，分別在壓力 1、2、5、8、10、15、20、30、40 MPa 下均質(zhì)改性，與對照樣品一起冷凍干燥，貯存。

1.3.2 拉曼光譜的測定及分析

拉曼光譜測定參照江連洲等[13]的方法，進行一定的修改，相關(guān)參數(shù)設(shè)定：發(fā)射功率80 mW，測量拉曼譜范圍為400～1800 cm-1，激發(fā)光波長785 nm，曝光時間60 s，每個樣品都重復(fù)掃描3次以上，由計算機做信號累加平均并繪圖輸出，峰位誤差控制在3 cm-1內(nèi)。掃描后各樣品的拉曼數(shù)據(jù)利用Origin 8.5軟件進行平滑處理，先進行基線校正，然后以苯丙氨酸（1003±1）cm-1作為歸一化因子[14]。采用 Peakfit Version軟件進行擬合分析各蛋白樣品二級結(jié)構(gòu)組分含量。圖表制作采用Origin 8.5軟件，歸一化處理苯丙氨酸1004 cm-1為內(nèi)標，使用SPSS 19.0進行ANOVA差異顯著性和方差分析（p＜0.05為顯著性差異）。

1.3.3 圓二色譜分析

圓二色譜的測定參照畢爽等[15]的方法，取樣品在20 ℃條件下10000 r/min離心后稀釋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。測定條件：掃描速率為100 nm/min，掃描波長范圍為250～200 nm，樣品池光程為0.1 nm，靈敏度為100 mdeg/cm，每個樣品重復(fù)3次測定。數(shù)據(jù)通過CDPro軟件進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 拉曼光譜分析

圖1 不同均質(zhì)條件下大豆分離蛋白拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectra of soy protein isolate under different homogenization conditions

低壓均質(zhì)處理對大豆蛋白在波長為 400～1800 cm-1的拉曼光譜如圖1所示，相關(guān)特征峰根據(jù)已有研究[16]，指認如表1所示。根據(jù)表中振動來源與波數(shù)的對應(yīng)關(guān)系可在圖1中標注出不同低壓均質(zhì)處理條件下大豆分離蛋白的拉曼譜帶。

表1 不同均質(zhì)條件下大豆分離蛋白的拉曼特征峰位及峰位歸屬Table 1 Characteristic Raman frequencies and tentative assignments of structures in SPI at different treatment

2.1.1 不同壓力對主鏈結(jié)構(gòu)的影響

大豆分離蛋白的構(gòu)象主要由酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的拉曼特征峰確定，酰胺Ⅰ帶是C=O與C-N鍵的伸張，而酰胺Ⅲ帶是C-N鍵的伸張和N-H在平面上的轉(zhuǎn)折。大豆分離蛋白酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的二級結(jié)構(gòu)拉曼光譜頻率及歸屬如表2所示。

蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶及酰胺Ⅲ帶常用于表征蛋白質(zhì)的主鏈結(jié)構(gòu)。拉曼譜圖中1665～1675 cm-1處譜帶強度大，表明大豆分離蛋白酰胺Ⅰ帶中主要存在β-折疊結(jié)構(gòu)及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶用于研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量的定量分析[17]，結(jié)果如表3所示。本實驗中大豆分離蛋白的拉曼圖譜二級結(jié)構(gòu)的定量計算使用Peakfit 4.12軟件完成。由于大豆分離蛋白酰胺Ⅲ帶的振動光譜產(chǎn)生頻帶在其范圍內(nèi)（位于1230～1310 cm-1）的圖形較復(fù)雜，故未進行定量分析。

表2 大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)拉曼光譜頻率及歸屬Table 2 Raman Spectra Frequency and ownership of Secondary structure of Soybean protein isolate

將大豆分離蛋白的酰胺Ⅰ帶用于研究低壓均質(zhì)后蛋白二級結(jié)構(gòu)變化情況的分析，實驗結(jié)果如表3所示。對比不同壓力下與未處理大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成可知，未處理的大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)組成為：24.46% α-螺旋、31.31% β-折疊、20.13% β-轉(zhuǎn)角及24.10%無規(guī)卷曲。與未處理條件相比，經(jīng)低壓均質(zhì)處理后大豆分離蛋白中各結(jié)構(gòu)組分含量呈現(xiàn)規(guī)律性變化趨勢。當均質(zhì)壓力較低（1～8 MPa）時，各結(jié)構(gòu)組分的含量變化不明顯，說明較低壓力下，蛋白結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯變化；隨著均質(zhì)處理程度的增強，大豆分離蛋白中β折疊結(jié)構(gòu)的含量顯著降低，α螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)明顯增多，可能是由于均質(zhì)處理下蛋白分子剛性結(jié)構(gòu)減弱，柔性結(jié)構(gòu)增加，分子由有序變得無序，這與郭麗等[18]人在20 MPa和30 MPa下觀察到蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的結(jié)果相似。

表3 拉曼光譜測定不同均質(zhì)處理大豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的含量Table 3 Determination of Secondary structure of Soybean protein with different homogenization by Raman Spectroscopy

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)隨蛋白質(zhì)聚合程度而變化，較高程度的蛋白質(zhì)聚合與穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)的積聚高度相關(guān)，α-螺旋和β-折疊構(gòu)象比例越高，表明低壓均質(zhì)處理大豆分離蛋白的有序結(jié)構(gòu)越多，蛋白質(zhì)聚合越強，而低壓均質(zhì)作用過程中蛋白粒徑減小，比表面積大幅增加，蛋白聚合程度增強，從而導致蛋白這種結(jié)構(gòu)單元變化的發(fā)生，與Xiong[19]、和Hou[20]的研究結(jié)果一致。同時，Lee等[21]人研究表明，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β-折疊構(gòu)象的增加和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的減少，表明形成了更多的聚合和穩(wěn)定的蛋白網(wǎng)絡(luò)，證明低壓均質(zhì)能夠使大豆分離蛋白趨向于有序的二級結(jié)構(gòu)，驗證了本研究中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的增加，β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)下降的趨勢。

2.1.2 不同壓力對側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的影響

2.1.2.1 色氨酸殘基的變化

760 cm-1附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側(cè)鏈，對于觀察蛋白質(zhì)微環(huán)境的極性及氫鍵變化規(guī)律有著重要作用。Ferrer等人[22]研究表明熱變性破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進而引起色氨酸殘基的暴露，在拉曼譜圖中表現(xiàn)為譜帶強度的降低。在本研究中，經(jīng)過10～30 MPa均質(zhì)處理的大豆分離蛋白拉曼光譜峰強度在760 cm-1附近區(qū)域顯著降低（p＜0.05），表明色氨酸殘基由“埋藏態(tài)”轉(zhuǎn)為“暴露態(tài)”，而均質(zhì)壓力為40 MPa時，色氨酸殘基則趨向“埋藏態(tài)”。

2.1.2.2 酪氨酸殘基的變化

酪氨酸的環(huán)吸收振動和面彎曲振動產(chǎn)生的特征振動頻率在830 cm-1、850 cm-1附近[23]。二者的相對強度（I850/I830）常用來鑒定酪氨酸組分埋藏和暴露的程度[24]。當I850/I830比值為1.25～1.40時，酪氨酸殘基趨向于“暴露”態(tài)；當I850/I830比值為0.3～0.5時，酪氨酸殘基趨向于“包埋”態(tài)；當I850/I830比值為0.7時，酪氨酸殘基呈電離態(tài)。通過研究這兩條譜線的強度比，還可知酪氨酸是作為氫鍵的供體還是受體[25]。當I850/I830為0.3時，表明酪氨酸的苯環(huán)上的羥基氧原子是強氫鍵的供體。當I850/I830為1.25，環(huán)上羥基氧原子同時作為中等強度氫鍵供體和受體。當I850/I830為2.5時，酪氨酸的苯環(huán)上羥基氧原子就成為一個強氫鍵受體[26]。

表4 不同處理條件下大豆分離蛋白側(cè)鏈基團譜帶強度Table 4 Band strength of side chain groups of soybean protein isolate under different treatment conditions

由表 4可知，本研究中 I850/I830比值均在0.902～1.130范圍內(nèi)，當均質(zhì)壓力超過10 MPa時，色譜峰強度明顯升高，大豆分離蛋白的酪氨酸殘基趨向于“暴露態(tài)”，說明經(jīng)過均質(zhì)處理后，大豆分離蛋白分子中的酪氨酸部分暴露在極性微環(huán)境中，并且作為中等強度氫鍵供體和受體；當均質(zhì)壓力增大到 40 MPa時，酪氨酸費米共振線I850/I830的比值顯著降低，即酪氨酸由原本的“暴露態(tài)”向“包埋態(tài)”轉(zhuǎn)變。綜合分析，經(jīng)過低壓均質(zhì)處理后，酪氨酸的苯環(huán)上的羥基氧原子由強氫鍵的供體向受體轉(zhuǎn)變。

2.1.2.3 脂肪族C-H鍵彎曲振動模式變化

由表4可知，CH2和CH3的彎曲振動在1450 cm-1波數(shù)附近可以觀察到，均質(zhì)壓力在0～40 MPa范圍內(nèi)，拉曼光譜中 1450 cm-1的譜帶強度隨著均質(zhì)壓力的增大呈先增加后下降的趨勢；均質(zhì)壓力為30 MPa時，樣品的譜帶強度達到最大值，但隨著均質(zhì)壓力的進一步增大，譜帶強度反而下降。在1450 cm-1處C-H鍵強度的增加說明蛋白質(zhì)分子展開，樣品中的疏水基團暴露到極性環(huán)境中[27]。

當均質(zhì)壓力進一步增加時，蛋白分子間由于相互作用形成聚集導致疏水基團包埋并向微極性環(huán)境轉(zhuǎn)變，譜帶強度降低。

2.1.2.4 二硫鍵構(gòu)型分析

二硫鍵是蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的重要維持力，在不同振動模式下所反應(yīng)出來的拉曼位移有所不同，500～510 cm-1處 gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式，515～525 cm-1為 gauche-gauche-trans（g-g-t）模式，535～545 cm-1為 trans-gauche-trans（t-g-t）模式[28]。

由圖1可知，當均質(zhì)壓力較低（0～40 MPa）時，大豆蛋白二硫鍵拉曼歸屬峰位于508 cm-1處，表明大豆分離蛋白中二硫鍵應(yīng)歸屬于 g-g-g振動模式，可以判斷，均質(zhì)處理并未顯著改變蛋白質(zhì)的二硫鍵構(gòu)型，大豆蛋白二硫鍵保持了分子內(nèi)構(gòu)型特征，這與江連洲[13]的研究結(jié)果一致。

2.2 圓二色譜分析

表5 低壓均質(zhì)處理對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響Table 5 Low pressure homogenization treatment of protein secondary structure

由表5可知，低壓均質(zhì)處理對大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)變化顯著（p＜0.05），大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成中以β-折疊構(gòu)象為主。當均質(zhì)壓力在1～8 MPa時，大豆分離蛋白基本保持原有二級結(jié)構(gòu)特征，僅β-折疊構(gòu)象含量發(fā)生了部分降低及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量的增加，由此可以證明大豆分離蛋白在低壓均質(zhì)作用下保持了原有分子結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量的增加可能與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的局部解折疊有關(guān)，β-折疊構(gòu)象含量的降低與蛋白聚集體解聚行為有關(guān)[29]。

當均質(zhì)壓力在10～30 MPa時，β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)變化顯著，β-折疊構(gòu)象含量迅速降低，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量明顯增加，同時伴隨著α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角的含量有所上升。Stathopulos等[30]研究表明，β-折疊結(jié)構(gòu)含量的降低與疏水基團暴露有關(guān)，β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低常伴隨著蛋白表面疏水性的增加?？赏茰y：當均質(zhì)壓力在10～30 MPa時，大豆分離蛋白分子結(jié)構(gòu)展開程度增大，疏水基團發(fā)生更大的暴露。當均質(zhì)壓力在30～40 MPa時，大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)中β-折疊構(gòu)象含量顯著增大，并伴隨著其他三種構(gòu)象含量的減少，由此表明在此壓力范圍內(nèi)，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲構(gòu)象轉(zhuǎn)化為β-折疊構(gòu)象，說明這可能與此狀態(tài)下大豆蛋白亞基聚集行為有關(guān)，進一步表明大豆分離蛋白形成了可溶性聚集。綜合拉曼分析結(jié)果可知，大豆分離蛋白在低壓均質(zhì)作用下既發(fā)生蛋白結(jié)構(gòu)的解折疊又伴隨著聚集體的生成。

3 結(jié)論

依據(jù)酰胺Ⅰ帶對大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)進行定量，可以發(fā)現(xiàn)10～30 MPa低壓均質(zhì)處理對二級結(jié)構(gòu)的影響顯著，即隨著均質(zhì)壓力的增大，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低，大豆分離蛋白的色氨酸殘基和酪氨酸殘基趨向于“暴露態(tài)”，蛋白分子表現(xiàn)出一種解聚的行為；而均質(zhì)壓力繼續(xù)增大到40 MPa過程中，酪氨酸費米共振線I850/I830比值略有下降，酪氨酸殘基由“暴露態(tài)”向“埋藏態(tài)”轉(zhuǎn)變，表明有聚集體的產(chǎn)生，并且圓二色譜的分析驗證了拉曼分析的結(jié)果，但低壓均質(zhì)處理并未顯著改變蛋白質(zhì)的二硫鍵構(gòu)型，上述結(jié)論為低壓均質(zhì)處理在食品加工過程中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。