范秀芝，殷朝敏，姚芬，史德芳，高虹

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北武漢 430064）

多糖（Polysaccharide）是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接成的天然高分子聚合物，它廣泛存在于高等植物、真菌、藻類、細(xì)菌及動(dòng)物體細(xì)胞中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一[1,2]。真菌多糖不僅作為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成和細(xì)胞中能量存儲(chǔ)分子發(fā)揮重要作用，還具有多種生物活性，如對(duì)心腦血管、腫瘤和急慢性炎癥等疾病具有預(yù)防和治療作用，在調(diào)節(jié)免疫、降血壓、降血糖、降低膽固醇和甘油三酯，抗腫瘤、抗炎、抗血小板凝集、抗氧化及抗衰老等方面具有獨(dú)特的生物活性，而且毒副作用低[3～7]。

黑木耳（Auricularia heimuer）[8]是一種藥食兼用的膠質(zhì)菌，在中國(guó)、泰國(guó)、韓國(guó)和日本等東南亞國(guó)家廣泛種植和消費(fèi)，是全球第三大栽培食用菌[9]。在中國(guó)，黑木耳子實(shí)體作為傳統(tǒng)食品和民間藥物已有1000多年的歷史，而且已有研究證實(shí)黑木耳具有多種生物學(xué)活性，包括增強(qiáng)免疫[10]、抗腫瘤[11]、抗病毒[12]、抗凝血[13]、抗氧化[14]、降血糖[15]、降血脂[16]、降低膽固醇[17]以及保護(hù)心臟[18]等功效，其中上述功效的明確主要來自對(duì)黑木耳子實(shí)體中多糖（胞內(nèi)多糖）的研究。

然而，食用菌子實(shí)體的生產(chǎn)受季節(jié)和氣候的影響較大，而且栽培周期長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，子實(shí)體中多糖的提取存在工藝繁瑣、提取效率低等問題。因此，近年來越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向具有生產(chǎn)周期短、成本低、易于控制，活性產(chǎn)量高、質(zhì)量好等優(yōu)勢(shì)的深層發(fā)酵（液體發(fā)酵）技術(shù)上。且已有研究表明液體發(fā)酵產(chǎn)物中具有與子實(shí)體相同的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味以及活性物質(zhì)，發(fā)酵產(chǎn)物中各類成分含量均顯著高于子實(shí)體[19]；液體發(fā)酵所得的多糖具有與子實(shí)體多糖相同的結(jié)構(gòu)[20]和活性[21,22]。

目前，在黑木耳中已有液體發(fā)酵研究主要集中在液體發(fā)酵菌株的篩選[23]，液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化、發(fā)酵所得胞內(nèi)或胞外多糖的抑菌性、抗氧化活性研究[24～27]，以及外源添加中藥提取物對(duì)黑木耳多糖合成、活性影響以及合成調(diào)控機(jī)理研究[28,29]。本研究，在優(yōu)化培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，開展液體發(fā)酵多糖，包括胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）和胞內(nèi)多糖（intracellular polysaccharide，IPS）的分離、純化以及官能團(tuán)分析，并對(duì)純化胞外和胞內(nèi)多糖的抗氧化和保濕性進(jìn)行比較研究，在明確二者異同的同時(shí)為開展黑木耳液體發(fā)酵多糖的合理利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

優(yōu)選的黑木耳菌株，黑木耳2號(hào)[23]（HME2，國(guó)家審定編號(hào)2007018）。

1.1.2 試劑

纖維素DEAE-52、葡聚糖凝膠Sephadex G-200，上海源葉生物科技有限公司；中性蛋白酶（50000 U/g），南京龐博生物工程有限公司；葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、無水乙醇、苯酚、硫酸、三氯甲烷、正丁醇、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鐵氰化鉀、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、雙氧水、三羥甲基氨基甲苯（Tris）、鄰苯三酚、甘油等試劑。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

液體完全培養(yǎng)基（LCYM）：葡萄糖20.00 g，蛋白胨 2.00 g，酵母膏 2.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，K2HPO41.00 g，KH2PO40.46 g，加蒸餾水定容至1.00 L，pH自然；

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（BFM）：葡萄糖20.00 g，蛋白胨 2.00 g，KH2PO42.00 g，MgSO4·7H2O 1.00 g，加蒸餾水定容至1.00 L，pH自然；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖28.67 g/L，麩皮117.83 g/L，MgSO4·7H2O 1.00 g/L，K2HPO42.00 g/L。麩皮浸泡30 min后，沸水煮30 min，取濾液用于發(fā)酵培養(yǎng)基[30]。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250L恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZWY-2102恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造廠；SW-CJ-1CU超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZM-80KCS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；FE-20 pH計(jì)，梅特勒；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；3K15高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma；101-2AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ-5200DE超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器公司；數(shù)控計(jì)滴SBS-100A自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；Nanodrop 2000C超微量分光光度計(jì)，美國(guó)熱電；BSC-250恒溫恒濕箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TENSOR 27傅立葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker。

1.3 方法

1.3.1 菌種制備及培養(yǎng)條件

菌種接種到含固體完全培養(yǎng)基的 90 mm平板于25 ℃培養(yǎng)5 d；用8 mm打孔器打孔后取接種塊接入30 mL LCYM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d；勻漿取5 mL菌液接種到100 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d；按1：10接種量吸取菌液接種到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。

1.3.2 多糖的分離、提取

培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液連同菌球于6000 r/min離心15 min，收集上清，用蒸餾水洗滌菌球2次，離心后合并上清液，60 ℃真空減壓濃縮，加入4倍體積無水乙醇于4 ℃沉淀過夜[27]；8000 r/min離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥后稱重得到胞外粗多糖，記EPS。

將洗滌后的菌球冷凍干燥、稱重，根據(jù)發(fā)酵液體積計(jì)算菌絲體產(chǎn)量（g/L）。粉碎過60目篩，按料液比1：10加入蒸餾水，于121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中提取1.5 h，冷卻后過濾出濾液，重復(fù)上述操作2次，合并濾液進(jìn)行減壓濃縮、醇沉，離心凍干后得胞內(nèi)粗多糖，記作IPS。

1.3.3 含量的測(cè)定

多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法。參考標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1676-2008繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=10.003X-0.022（R2=0.996）。將干燥至恒重的粗多糖研磨成粉末，精確稱取0.50 g用蒸餾水溶解并定容至100 mL，按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的苯酚-硫酸法濃度測(cè)定步驟，測(cè)定樣品490 nm處吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多糖含量（C，g/100 g）。并由此計(jì)算出多糖產(chǎn)量（Y，g/L）：

其中，C為多糖含量；m為粗多糖EPS或IPS的重量，g；V是發(fā)酵液體積，L。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.3.4 粗多糖除蛋白

采用酶-Sevag法去除粗多糖EPS和IPS中蛋白質(zhì)。將干燥粗多糖制成1.00%（m/V）的多糖水溶液，加入多糖質(zhì)量3.00%的中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH到7.0，42 ℃酶解3 h。室溫下將多糖水溶液和Sevag試劑[氯仿：正丁醇=4：1(V/V)]按 4：1體積比混合，充分振搖，4000 r/min離心15 min，收集上層水相。重復(fù)上述步驟直至水相和有機(jī)相間無明顯白色粘稠物質(zhì)，期間取上層水相，用超微量分光光度計(jì)掃描其在220～400 nm波長(zhǎng)內(nèi)吸光度，確保在260 nm和280 nm處無明顯的吸收峰。最后將除蛋白的多糖水溶液濃縮、醇沉，冷凍干燥得到除蛋白的多糖樣品DEPS和DIPS。苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量（p，%），計(jì)算多糖損失率（L，%）。

式中，L為多糖損失率；md為DEPS或DIPS產(chǎn)量，g/L；p為DEPS或DIPS的純度；Y為式（1）中對(duì)應(yīng)EPS和IPS的產(chǎn)量，g/L。

1.3.5 多糖的柱層析分離純化

選用 26 mm×30 cm玻璃層析柱，稱取 50.00 g DEAE-52粉末，超純水浸泡過夜，裝柱，0.01 mol/L pH 7.8的PBS溶液平衡柱子。準(zhǔn)確稱取200 mg去除蛋白的多糖粉末溶于10 mL超純水中，0.45 μm微孔濾膜過濾上樣，依次用PBS、0.10 mol/L NaCl-PBS、0.20 mol/L NaCl-PBS、0.30 mol/L NaCl-PBS溶液各125 mL進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，每5 mL收集一管[32]。

苯酚-硫酸法測(cè)定每管490 nm波長(zhǎng)處吸光度，以收集的管號(hào)對(duì)應(yīng)吸光值作圖得洗脫曲線，根據(jù)出峰情況收集各組分，濃縮、透析，醇沉后凍干。

將多糖含量最多的組分用Sephadex G-200進(jìn)一步分離純化，流動(dòng)相選用0.10 mol/L NaCl溶液，上樣前柱子用流動(dòng)相平衡10 h。超純水溶解多糖組分制成20 mg/mL溶液，1 mL上樣，流速為0.3 mL/min，3 mL/管，收集液用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，繪制洗脫曲線，合并同一色譜峰的各管收集液為單一組分，濃縮、透析，醇沉凍干備用，分別記PEPS和PIPS。

1.3.6 紅外光譜分析

取充分干燥的純化多糖組分2.00 mg，分別與KBr混合，研磨后壓片，放入傅里葉變換紅外光譜儀內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描區(qū)間為400～4000 cm-1。

1.3.7 液體發(fā)酵黑木耳多糖抗氧化活性研究

1.3.7.1 還原能力的測(cè)定

吸取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 mg/mL的純化多糖組分溶液各2.5 mL，分別加入2.5 mL PBS緩沖液（0.2 mol/mL，pH=6.6）和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀，混勻后于50 ℃水浴反應(yīng)20 min。向反應(yīng)液加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，混勻后1000 r/min離心10 min，取5.0 mL上清液，加入5.0 mL蒸餾水和1.0 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min測(cè)定700 nm處吸光度[33]。用相同濃度的抗壞血酸（Vc）水溶液作陽性對(duì)照，每個(gè)濃度三個(gè)平行，取平均值（下同）。1.3.7.2 羥基自由基清除能力測(cè)定

番紅在520 nm處有最大紫外吸收峰，通過利用H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基（·OH）可特異地使番紅褪色原理，根據(jù)番紅褪色程度來表示羥基自由基含量[33]。吸光度越大，表明羥基自由基含量越少，樣液清除羥基自由基能力越強(qiáng)。

配制反應(yīng)體系，總體積為10.0 mL，包括1.0 mL PBS緩沖液（150 mmol/mL，pH=7.4），2.0 mL番紅溶液（520 μg/mL），1.0 mL EDTA-Na2-Fe2+溶液（6 mmol/mL），0.8 mL新鮮配制0.3% H2O2溶液，0.5 mL不同濃度（0.5～20.0 mg/mL）的多糖溶液和4.7 mL蒸餾水。40 ℃恒溫水浴30 min，取出冷卻20 min后測(cè)定520 nm處吸光度Ai。對(duì)照組不添加多糖溶液，吸光度記Ac；空白組以蒸餾水代替H2O2和多糖溶液，吸光度記A0。以相同濃度的Vc水溶液作陽性對(duì)照。

1.3.7.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別取 4.0 mL不同濃度多糖溶液（0.05～0.80 mg/mL）加入1.0 mL DPPH溶液（0.2 mmol/mL），震蕩混勻，室溫下避光靜置30 min，測(cè)定517 nm處吸光度Ai；取4.0 mL不同濃度多糖溶液加1.0 mL無水乙醇作為空白組，搖勻后室溫放置30 min，測(cè)定吸光度為A0；取4.0 mL DPPH溶液加1.0 mL無水乙醇作對(duì)照組，混勻后室溫靜置30 min，測(cè)定吸光度為Ac。相同濃度的Vc水溶液作陽性對(duì)照，操作方法同上。

1.3.7.4 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

取Tris-HCl（50 mmol/L，pH=8.2）緩沖液4.5 mL，25 ℃平衡 20 min，分別加入 0.1 mL不同濃度（0.05～0.50 mg/mL）的多糖溶液，然后加入0.2 mL 5 mmol/mL鄰苯三酚溶液（10 mmol/L HCl溶液配制），混勻后25 ℃保溫10 min，迅速加入10 mol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，立即于320 nm下測(cè)吸光度記Ai。10 mmol/mL HCl代替鄰苯三酚溶液做空白組，測(cè)定吸光度為A0；對(duì)照組以蒸餾水多糖溶液，吸光度為Ac。相同濃度的Vc水溶液作對(duì)照，操作方法同上。

1.3.8 多糖體外保濕性評(píng)價(jià)

參照文獻(xiàn)[34,35]，將純化多糖和甘油分別用蒸餾水配成5%的溶液，選用60 mm培養(yǎng)皿（恒重），分別在培養(yǎng)皿內(nèi)側(cè)貼一層3 M醫(yī)用透氣膠帶，分別吸取多糖溶液、甘油溶液、蒸餾水各500 μL點(diǎn)在透氣膠帶上，稱重后放入25 ℃相對(duì)濕度60%的恒溫恒濕箱內(nèi)6 h，每隔1個(gè)小時(shí)稱重一次，據(jù)與初始重量差計(jì)算保濕率：

注：M0為初始重量，g；Mt為取樣點(diǎn)重量，g；t為取樣時(shí)間，h。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理，再使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，以p＜0.05和p＜0.01判斷差異顯著性程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（mean±SD）表示。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 液體發(fā)酵黑木耳多糖含量

發(fā)酵結(jié)束后，得到粗多糖EPS 21.50±0.51 g/L，苯酚-硫酸法檢測(cè)得胞外多糖的含量為48.79±0.11 g/100 g，由公式（1）得胞外多糖產(chǎn)量為10.49±0.27 g/L，顯著高于其他黑木耳品種液體發(fā)酵胞外多糖產(chǎn)量[24～29]。凍干菌絲體產(chǎn)量為24.78±0.63 g/L，高壓熱水浸提得到粗多糖IPS產(chǎn)量為4.23±0.03 g/L，苯酚-硫酸法檢測(cè)胞內(nèi)多糖的含量為72.13±0.17 g/100 g，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為3.05±0.03 g/L。醇沉所得EPS和IPS中蛋白質(zhì)含量分別為7.96±0.61 g/L和0.67±0.06 g/L。酶-Sevag法脫除粗多糖EPS和IPS中蛋白質(zhì)后得到DEPS和DIPS分別為9.83±0.27 g/L 和2.79±0.04 g/L，苯酚-硫酸法檢測(cè)DEPS和 DIPS中多糖含量分別為 95.22±0.91%和98.50±0.30%，表明酶-Sevag法可以很好的脫除黑木耳液體發(fā)酵所得EPS和IPS中蛋白質(zhì)。由公式（2）計(jì)算胞外和胞內(nèi)多糖損失率為 10.75±0.77%和10.06±0.67%，表明酶-Sevag法在脫蛋白提高多糖純度的同時(shí)會(huì)造成一定的多糖損失，分析原因可能是部分糖鏈與蛋白質(zhì)共價(jià)相連構(gòu)成糖蛋白而被去除?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定 DEPS和 DIPS中蛋白質(zhì)含量分別為0.43±0.17 g/L和0.03±0.01 g/L，這些未被完全去除蛋白質(zhì)的存在使得多糖純度達(dá)不到100%。

2.2 多糖分離純化

DEAE-52纖維素柱層析對(duì)200 mg DEPS和DIPS分離純化結(jié)果見圖1。由洗脫曲線可以看出，DEPS（a）只有一個(gè)主峰（DEPS-I），分析原因可能是優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件在提高胞外多糖產(chǎn)量的同時(shí)可使其組分更加單一化。DIPS（b）的在PBS洗脫液中有一個(gè)主峰（DIPS-I），另在0.10 mol/L NaCl-PBS和0.20 mol/L NaCl-PBS洗脫液中有2個(gè)小峰（DIPS-II和DIPS-III）。分別收集DEPS和DIPS最多的組分DEPS-I和DIPS-I，經(jīng)濃縮、透析、醇沉后得凍干樣品167.64±3.48 mg和132.72±2.64 mg，回收率分別為 83.82±1.74%和66.36±1.32%。

圖1 除蛋白多糖DEPS（a）和DIPS（b）的DEAE-52柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of the deproteinized polysaccharide DEPS(a) and DIPS (b) by column chromatography of DEAE-52

圖 2 多糖分離組分DEPS-I（a）和 DIPS-I（b）的 Sephadex G-200柱層析純化曲線Fig.2 Sephadex G-200 column chromatographic purification curves of the polysaccharide components DEPS-I (a) and DIPS-I (b)

將DEPS-I和DIPS-I用Sephadex G-200進(jìn)一步分離純化，洗脫曲線如圖2?？梢钥闯?，DEPS-I和DIPS-I組分都是單峰，表明采用 DEAE-52分離所得 DEPS和DIPS各組分是可靠的。從峰形來看，DIPS-I的峰型較DEPS-I的對(duì)稱性好且峰寬，表明DIPS-I組分的分子量分布較 DEPS-I的廣。分別收集 DEPS-I和DIPS-I經(jīng) 0.10 mol/L NaCl溶液洗脫的第7～20管和5～20管，經(jīng)濃縮、透析、醇沉后得凍干樣PEPS和PIPS。

稱重后計(jì)算回收率分別為 93.63±2.76%和95.85±2.02%，表明 DEPS-I和 DIPS-I純度較高，即DEAE-52對(duì)黑木耳液體發(fā)酵多糖組分的分離效果好。因此，在后續(xù)的黑木耳液體發(fā)酵多糖應(yīng)用中可只用DEAE-52進(jìn)行一次分離純化，既可節(jié)省時(shí)間又能節(jié)約成本。

2.3 紅外光譜分析

圖3 多糖組分PEPS（a）和PIPS（b）的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of PEPS (a) and PIPS (b)

PEPS和PIPS紅外光譜官能團(tuán)分析見圖3。PEPS（a）和PIPS（b）的峰型基本一致，且與已報(bào)道的黑木耳子實(shí)體多糖[37～39]、固體發(fā)酵菌質(zhì)多糖[36]以及液體發(fā)酵胞外多糖[29]的紅外圖譜相似，PEPS（a）和PIPS（b）分別在3396.09 cm-1和3398.01 cm-1處有強(qiáng)的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰，在2925.53 cm-1和2927.46 cm-1處具有C-H伸縮振動(dòng)峰，這兩處吸收峰為多糖類物質(zhì)的典型特征峰[29,36,37]。PEPS（a）和 PIPS（b）在 1654.65 cm-1處吸收峰可能由 C=O伸縮振動(dòng)導(dǎo)致[37]，或因存在結(jié)合水[38,40]或少量蛋白質(zhì)[41]。PEPS（a）和PIPS（b）分別在1407.80 cm-1和1411.66 cm-1處有C-H變角振動(dòng)吸收峰，在1200～1000 cm-1范圍內(nèi)各有三個(gè)由C-O-H和吡喃糖環(huán)C-O-C中C-O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，說明 PEPS和 PIPS是吡喃型多糖[29,36,37,39,41]；PEPS和PIPS分別在931.46 cm-1和935.32 cm-1處有吸收峰，與 β-糖苷鍵的存在有關(guān)，推測(cè)黑木耳液體發(fā)酵 PEPS和PIPS為β-構(gòu)型[38]吡喃糖。此外，PIPS在1243.88 cm-1處有S=O對(duì)稱拉伸振動(dòng)吸收峰[42]，表明PIPS中存在硫酸根。

2.4 多糖的抗氧化活性研究

2.4.1 還原力

圖4 黑木耳液體發(fā)酵PEPS和PIPS還原力Fig.4 The reducing power of PEPS and PIPS from submerged fermentation of A. heimuer

由圖4可知，在0.5～20.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，黑木耳純化PEPS、PIPS的還原力與其濃度均呈良好的線性關(guān)系（YPEPS=0.1129+0.0984X，R2=0.9996；YPIPS=0.1040+0.0598X，R2=0.9983），隨著濃度的增加，還原力逐漸增強(qiáng)。在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，DEPS的還原力極顯著高于PIPS的（p＜0.01），且隨著濃度的增加差異性越來越大，這與已報(bào)道的未純化黑木耳液體發(fā)酵胞外和胞內(nèi)多糖還原力比較結(jié)果相反[27]，推測(cè)原因可能是所用培養(yǎng)基組成不同，改變了PEPS的單糖組成[29]，從而提高了其還原力。與 Vc相比，PEPS和PIPS還原力均顯著低于同濃度的Vc，這與已有報(bào)道一致[26,27]。

2.4.2 對(duì)羥自由基（·OH）清除能力

圖5 黑木耳液體發(fā)酵PEPS和PIPS對(duì)羥基自由基的清除效果Fig.5 Scavenging capacity of PEPS and PIPS from submerged fermentation of A. heimuer on hydroxyl free radicals

濃度在0.5～20.0 mg/mL之間，各樣品的羥基自由基清除率隨著濃度的增加而增大（圖5）。當(dāng)濃度在0.5～5.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，PEPS和PIPS的羥基自由基清除能力均顯著高于 Vc（p＜0.01）；在濃度大于 5.0 mg/mL時(shí)，PEPS的羥基自由基清除能力極顯著低于 Vc（p＜0.01），而 PIPS的清除能力與 Vc差異不顯著（p＜0.05），清除率為81.03±2.92%，表明PIPS抗氧化力較強(qiáng)。在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)PIPS的清除能力始終高于PEPS，表明黑木耳液體發(fā)酵胞內(nèi)多糖羥基自由基清除能力顯著高于胞外多糖的，與報(bào)道未純化液體發(fā)酵胞內(nèi)和胞外多糖清除羥基自由基能力比較結(jié)果一致[27]。

2.4.3 對(duì)DPPH自由基清除能力

圖6 黑木耳液體發(fā)酵PEPS和PIPS對(duì)DPPH 自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacity of PEPS and PIPS from submerged fermentation of A. heimuer on DPPH free radicals

由圖6可知，隨著濃度的增加，Vc、PEPS和PIPS對(duì)DPPH自由基清除能力均有所增加，其中PEPS和PIPS增加幅度明顯大于Vc。當(dāng)濃度在0.05～0.4 mg/mL時(shí)，DPPH 自由基清除能力為 Vc＞PEPS＞PIPS，而當(dāng)濃度大于0.4 mg/mL時(shí)，PEPS和PIPS的DPPH自由基清除能力迅速增強(qiáng)超過Vc的，其中PIPS的DPPH自由基清除清除率顯著高于PEPS和Vc的（p＜0.05），最高為98.77±1.73%。PIPS較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，可能是因?yàn)槠涞秒娮幽芰Ω鼜?qiáng)，與DPPH自由基上電子結(jié)合更快，從而使其清除率更高[33]。

2.4.4 對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力

圖7 黑木耳液體發(fā)酵PEPS和PIPS對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Fig.7 Scavenging capacity of PEPS and PIPS from submerged fermentation of A. heimuer on superoxide anion free radicals

由圖7可知，當(dāng)濃度在0.05～0.5 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，Vc、PEPS和PIPS對(duì)超氧陰離子自由基清除能力隨著濃度的增加而提高。當(dāng)濃度≤0.2 mg/mL時(shí)，PIPS的超氧陰離子自由基清除能力顯著高于PEPS的（p＜0.05），但清除率僅為68.20±0.86%；而當(dāng)濃度≥0.3 mg/mL時(shí)，PEPS的超氧陰離子自由基清除率超過PIPS，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，PEPS的超氧陰離子自由基清除率最高為85.79±1.60%，顯著高于PIPS的（p＜0.05），這與已報(bào)道未純化胞內(nèi)和胞外多糖的研究結(jié)果一致[27]。

2.5 多糖的保濕性評(píng)價(jià)

圖8 黑木耳液體發(fā)酵PEPS和PIPS的保濕效果Fig.8 Moisturizing effect of PEPS and PIPS from submerged fermentation of A. heimuer

25 ℃相對(duì)濕度60%條件下5%的PEPS、PIPS溶液以及5%甘油溶液在一定時(shí)間內(nèi)的保濕率如圖8所示。隨時(shí)間延長(zhǎng)，3種樣品的保濕性均呈下降趨勢(shì)，比較檢測(cè)周期內(nèi)PEPS和PIPS的保濕率發(fā)現(xiàn)：6 h內(nèi)，PIPS的保濕率均高于PEPS的，但僅在第3 h和第6 h表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)（p＜0.01），表明純化所得黑木耳液體發(fā)酵胞內(nèi)多糖保濕效果稍優(yōu)于胞外多糖的，推測(cè)可能是PIPS含有較多的羥基等親水性基團(tuán)，能夠吸附更多的水分子，從而表現(xiàn)出更好的保濕效果。與 5%甘油溶液相比，PIPS在1～3 h內(nèi)保濕率高于甘油的，雖差異不顯著，但5% PIPS 3 h后保濕率仍在80%以上（81.63±2.09%），表明純化的液體發(fā)酵黑木耳胞內(nèi)多糖3 h內(nèi)具有良好的保濕效果。

3 結(jié)論

利用優(yōu)選的黑木耳菌株和優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵獲得胞外和胞內(nèi)粗多糖產(chǎn)量分別為 10.49±0.27 g/L和3.05±0.03 g/L，經(jīng)除蛋白與分離純化獲得單一的純化組分PEPS和PIPS，通過紅外光譜官能團(tuán)分析推測(cè)二者均為β-構(gòu)型吡喃糖。比較2種多糖組分的抗氧化活性和保濕性發(fā)現(xiàn)，PEPS在還原力、超氧陰離子自由基清除能力方面優(yōu)于PIPS，而PIPS在DPPH自由基、羥基自由基清除能力以及保濕性能方面優(yōu)于PEPS。本研究為黑木耳液體發(fā)酵多糖不同組分的合理利用提供依據(jù)，為它們?cè)谑称?、化妝品等方面的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。