周林艷，羅居?xùn)|，嚴(yán)菊芳，萬(wàn)美珍

(1.常州市金壇區(qū)人民醫(yī)院病理科，江蘇 常州 213200;2.常州市第四人民醫(yī)院，江蘇 常州 213001)

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的惡性能力是全世界面臨的共同問(wèn)題之一。泛素特異性蛋白酶4(USP4)是去泛素酶家族中泛素特異性修飾酶中的一個(gè)亞型，它在腫瘤中的機(jī)制尚不清楚。它是通過(guò)作用于目標(biāo)蛋白參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)在誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞和刺激腫瘤細(xì)胞遷移方面具有重要作用，是許多腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[1]。USP4可以調(diào)節(jié)MMP2的表達(dá)從而參與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程。本文旨在應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)USP4和MMP2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)，探討其表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，以及兩者的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討USP4參與宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供初步依據(jù)，并為腫瘤治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料收集常州市金壇區(qū)人民醫(yī)院病理科2010年1月至2013年12月的宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本70例，所有病例手術(shù)前均未行放化療?；颊吣挲g(59±6)歲，年齡范圍為32～81歲，病理分型均為鱗狀細(xì)胞癌，其中低分化(組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí))15例，高中分化(組織學(xué)分級(jí)Ⅰ+Ⅱ級(jí))55例。浸潤(rùn)深度≥1/2間質(zhì) 27 例，<1/2間質(zhì) 43 例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 48例。癌灶≥4 cm者19 例，<4 cm者51 例。同時(shí)取相應(yīng)的癌旁基本正常的子宮頸鱗狀上皮作為對(duì)照。本研究經(jīng)常州市金壇區(qū)人民醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2方法所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片后，在美國(guó)羅氏公司BenchMarkXT全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)上進(jìn)行染色。主要試劑鼠抗人USP4單克隆抗體、鼠抗人MMP2單克隆抗體均購(gòu)自Invitrogen公司。稀釋比例分別為1∶500，1∶200。以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照組，已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。操作步驟均嚴(yán)格按照羅氏診斷優(yōu)化程序進(jìn)行?；具^(guò)程為：4 μm切片脫蠟，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活動(dòng)，抗原修復(fù)，滴加10%正常山羊血清2滴封閉非特異染色后，順序加一抗、二抗室溫靜置1 h后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木精對(duì)比染色，常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下觀察結(jié)果。

1.3結(jié)果判斷

1.3.1USP4蛋白 在光學(xué)顯微鏡下觀察每張切片選取5個(gè)高倍視野(10×40)計(jì)數(shù)細(xì)胞。陽(yáng)性表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞核內(nèi)，少量定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。陽(yáng)性結(jié)果采用雙積分進(jìn)行半定量判定，表達(dá)面積的百分比與染色強(qiáng)度的乘積為總分。以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占所計(jì)數(shù)的腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比進(jìn)行評(píng)分，其中<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，≥50%為3分。染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者相乘時(shí)：0～2分為陰性，3～5分為+，6～9分為++，判定<3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性[2]。所有閱片均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生獨(dú)立完成，取平均值。

1.3.2MMP2蛋白 在光學(xué)顯微鏡下觀察每張切片選取5個(gè)高倍視野(10×40)計(jì)數(shù)細(xì)胞。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性染色。陽(yáng)性結(jié)果采用雙積分進(jìn)行半定量判定，表達(dá)面積的百分比與染色強(qiáng)度的乘積為總分。染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色面積：陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)的全部癌細(xì)胞百分率≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。將兩者相乘：≤4分為陰性，>4分為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 12.0，計(jì)數(shù)資料組間比較及兩者的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1USP4蛋白、MMP2蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)USP4蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞核內(nèi)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)時(shí)在胞質(zhì)內(nèi)也有著色。在70例子宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中43例呈陽(yáng)性(61.4%)，其中強(qiáng)陽(yáng)性36例(圖1A)，弱陽(yáng)性7例。在相應(yīng)的70例癌旁正常鱗狀上皮中陽(yáng)性表達(dá)率為8.0%(6/70)，多定位于細(xì)胞核上(圖1B)，均呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)。兩者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MMP2蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，同時(shí)在間質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，包括成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等(圖1C)。在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中陽(yáng)性表達(dá)率為44.3%，在正常鱗狀上皮中陽(yáng)性表達(dá)率為4.3%，定位于胞質(zhì)內(nèi)(見(jiàn)圖1D)，均呈弱陽(yáng)性表達(dá)。兩者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 宮頸鱗癌及正常組織中USP4、MMP2的表達(dá)/例(%)

2.2子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中USP4與MMP2表達(dá)的相關(guān)性70例宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中，43例USP4表達(dá)陽(yáng)性，其中25例MMP2同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性。39例MMP2表達(dá)陰性中，21例USP4同時(shí)表達(dá)陰性。兩者表達(dá)呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.67，P<0.05)。

2.3子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中USP4、MMP2蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系USP4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)(P<0.05);MMP2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)(P<0.05)，但均與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 USP4、MMP2與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例(%)

3 討論

去泛素化酶是一大類數(shù)量眾多的蛋白酶家族，不僅在正常細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮作用，也被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，去泛素化酶通過(guò)作用下游蛋白影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括酶、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)傳導(dǎo)分子等，有的是癌基因或抑癌基因的產(chǎn)物[3]。泛素特異性蛋白酶是去泛素化酶家族中種類最多且結(jié)構(gòu)最具多樣性的一個(gè)亞類，包括USP1、USP2、USP3、USP4……USP54和CYLD等[4]。它們分別在多種腫瘤中表達(dá)和作用各異。USP4作為癌基因在多種腫瘤中表達(dá)不同，有的腫瘤中呈高表達(dá)，如肝癌[5]、黑色素瘤等，但在肺癌[6]、頭頸部鱗癌[7]中呈低表達(dá)。與腫瘤相關(guān)的可能機(jī)制是影響一些關(guān)鍵癌基因的穩(wěn)定性或調(diào)節(jié)與泛素化相關(guān)的信號(hào)通路[8]。本研究檢測(cè)了癌旁正常宮頸組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中USP4的表達(dá)。結(jié)果顯示，USP4在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率比癌旁組織顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示USP4的高表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到在伴有和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中USP4陽(yáng)性率有明顯差異，提示宮頸鱗狀細(xì)胞癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與USP4高表達(dá)有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)深度≥1/2間質(zhì)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中USP4陽(yáng)性率明顯高于浸潤(rùn)深度<1/2間質(zhì)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌，表明檢測(cè)USP4在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)可以預(yù)測(cè)其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及其惡性程度，這為臨床評(píng)估預(yù)后和制訂治療方案提供了新思路，有望提高患者生存率。實(shí)驗(yàn)初步認(rèn)為USP4在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小及組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)，進(jìn)一步明確需要更多的實(shí)驗(yàn)完善。

對(duì)于MMP2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義已有一些研究，提示MMP2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用，其高表達(dá)加強(qiáng)降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)成分，是宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)MMP2在癌旁正常宮頸鱗狀上皮組織中顯示陰性表達(dá)或微弱表達(dá)，而在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且發(fā)現(xiàn)在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MMP2陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高。浸潤(rùn)深度≥1/2間質(zhì)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中MMP2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于浸潤(rùn)深度<1/2間質(zhì)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌，提示正常細(xì)胞間連接存在穩(wěn)定狀態(tài)，而腫瘤細(xì)胞因?yàn)镸MP2表達(dá)增強(qiáng)而加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞之間的連接和間質(zhì)的束縛，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

本組宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，USP4與MMP2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。提示USP4的高表達(dá)可能促進(jìn)了MMP2的表達(dá)，因而增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的能力。USP4在腫瘤中的作用機(jī)制尚不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)它可以激活腫瘤細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路[9]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在不同類型的癌癥中起著重要作用，它可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞的MMP表達(dá)，包括MMP2、MMP7，從而影響腫瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲[10]。我們的實(shí)驗(yàn)也初步顯示USP4與MMP2表達(dá)的正相關(guān)性，由此可以初步推斷，在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，USP4蛋白可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路而加強(qiáng)MMP2蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的能力。近來(lái)也有研究[11]發(fā)現(xiàn)AKT信號(hào)通路的磷酸化調(diào)節(jié)USP4的表達(dá)，而直接引起轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體的去泛素化，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移，我們將在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中研究在宮頸癌中USP4與MMP2之間的作用通路。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)USP4與MMP2的表達(dá)水平，探討宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵分子的相互作用，有助于患者預(yù)后判斷及治療指導(dǎo)，為進(jìn)一步研究宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供思路。