樊超，鐘藝青，粟蕓，李會娟，吳方評，金蘋

(湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南 懷化 418000)

二氫槲皮素別名花旗松素、紫杉葉素、黃杉素、雙氫櫟精，是藥用植物中存在的一種重要的二氫黃酮醇類化合物，屬于維生素PP族。研究表明，二氫槲皮素具有抗腫瘤[1-3]、抗氧化[4-5]、抗病毒[6-7]和抗心血管系統(tǒng)疾病等生物活性作用，在藥品、保健品、食品、煙草等行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。二氫楊梅素也是一種重要的二氫黃酮醇類化合物，研究表明，其具有抗腫瘤[8-10]、抗氧化[11]、抗炎[12]、解酒護(hù)肝[13]、抗病原微生物[14]、降血糖[15]、抗疲勞和調(diào)血脂等方面的作用。兩種二氫黃酮醇的結(jié)構(gòu)非常相似(圖1)，本實(shí)驗(yàn)擬用光譜法研究二氫槲皮素和二氫楊梅素與血清白蛋白(BSA)作用機(jī)制，以了解它們在人體內(nèi)的儲存、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等情況，同時(shí)對兩種二氫黃酮醇的深入開發(fā)也具有重要意義。

注：A為二氫槲皮素；B為二氫楊梅素

圖1兩種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1儀器與試劑熒光分光光度計(jì)F-7000(日本日立公司)；UV-4802型紫外分光光度計(jì)(UNIC公司)；牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，相對分子量65 000)5.0 ×10-5mol·L-1(即稱取約0.032 5 g BSA晶體溶于二次蒸餾水并定容至10 mL)，使用前配成1×10- 6mol·L-1；二氫槲皮素 (貴州迪大生物有限公司，純度≥98%，批號：GZDD-0121)使用前用無水甲醇配成1×10-6、2×10-6、3×10-6、4×10-6、5×10-6、6×10-6、7×10-6、8×10-6、9×10-6、10×10-6mol·L-110種不同濃度的溶液；二氫楊梅素(貴州迪大生物有限公司，純度≥98%，批號：480-18-2)使用前用無水甲醇配成0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、5.4×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6、8.1×10-6、9.0×10-6mol·L- 110種不同濃度的溶液；0.1 mol·L-1(pH=7.3)Tris-HCl緩沖溶液；0.5 mol·L-1NaCl水溶液；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水(電導(dǎo)率1.7 mS·cm-1)。

1.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)選(1)BSA的濃度范圍：實(shí)驗(yàn)表明BSA濃度在1.20 ×10-7～2.00 ×10-6mol·L-1范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與其濃度成正比，故實(shí)驗(yàn)中BSA濃度選擇1.0 ×10-6mol·L-1；(2)緩沖介質(zhì)的選擇：測試了BSA在Tris-HCl、Na2B4O7-H3BO3和Na2HPO4-NaH2PO4三種緩沖溶液中的熒光穩(wěn)定情況，發(fā)現(xiàn)BSA在Tris-HCl緩沖溶液中穩(wěn)定性較好，因而選定Tris-HCl作為實(shí)驗(yàn)的緩沖作用溶液；(3)pH 的影響：在Tris-HCl緩沖溶液中，pH于4.0～9.0范圍內(nèi)測定BSA的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)pH在6.0～7.5范圍內(nèi)BSA熒光強(qiáng)度相對穩(wěn)定，所以選擇與人體體液相近的pH=7.3;(4)離子強(qiáng)度的影響：NaCl濃度在0.10～0.35 mol·L- 1范圍內(nèi)對BSA熒光強(qiáng)度影響不太明顯，因而實(shí)驗(yàn)選定0.10 mol·L- 1的NaCl溶液作為測定BSA熒光時(shí)的離子強(qiáng)度。

1.3熒光光譜的測定在選定條件下， 10支10 mL比色管中分別加入1 mL Tris-HCl緩沖液、1 mL 0.5 mol·L-1的NaCl溶液、1 mL二次蒸餾水、0.1 mL 5×10-5mol·L-1BSA溶液和不同濃度的二氫黃酮溶液，用甲醇定容至5 mL，將比色管分別置于18、25、30 ℃的水浴鍋中反應(yīng)5 min，設(shè)定激發(fā)狹縫寬度為2.5 nm、發(fā)射狹縫寬度為5 nm，掃描速度為1 200 nm·min-1，在激發(fā)波長為280 nm的激發(fā)下，于290～450 nm范圍內(nèi)掃描，分別得到二氫槲皮素和二氫楊梅素的熒光猝滅光譜(見圖2和圖3)。

2 結(jié)果

2.1熒光光譜的研究在BSA中，由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三種芳香族氨基酸的存在，故使BSA存在內(nèi)源熒光，而色氨酸的熒光強(qiáng)度大于其他兩種，所以BSA熒光強(qiáng)度的變化可直接反映色氨酸殘基及其周圍環(huán)境的變化。以不同濃度的二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA的作用體系來看，隨著兩種二氫黃酮濃度的增加，在341 nm左右兩種體系的熒光發(fā)射強(qiáng)度均出現(xiàn)有規(guī)律的被猝滅現(xiàn)象，且最大發(fā)射波長均有一定程度的藍(lán)移情況。說明兩種小分子二氫黃酮醇引入后與BSA發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，并生成了熒光較弱或不發(fā)熒光的物質(zhì)。

2.2熒光猝滅類型的判斷熒光的猝滅類型分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅可用動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv來描述猝滅劑與熒光物質(zhì)之間的相互作用的程度及性質(zhì)；靜態(tài)猝滅可用靜態(tài)結(jié)合常數(shù)K來描述猝滅劑與熒光物質(zhì)之間相互作用的程度和性質(zhì)。

激發(fā)態(tài)時(shí)猝滅劑與熒光物質(zhì)分子之間的相互作用過程可通過動態(tài)猝滅得到反映，其作用規(guī)律遵循Stern-Volmer方程:

F0/F=1+KQτ0CQ=1+KsvCQ

式中：F0為未加入猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；F為猝滅劑濃度等于CQ時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；KQ為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命;Ksv為Stern-Volmer雙分子猝滅速率常數(shù)，看作是雙分子猝滅速率常數(shù)與單分子衰變速率常數(shù)的比率。

靜態(tài)猝滅則可認(rèn)為是基態(tài)時(shí)猝滅劑與熒光物質(zhì)生成熒光較弱或不發(fā)熒光的復(fù)合物，可用下列方程來描述：

F0/F=1+KCQ

式中：K為基態(tài)復(fù)合物的形成常數(shù)。

從溫度影響、熒光壽命和吸收光譜等三方面判斷猝滅類型：(1)溫度影響:靜態(tài)猝滅時(shí)，分子復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度的升高而下降，因而猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小；動態(tài)猝滅時(shí)，溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)增大，雙分子的猝滅常數(shù)增大，因而動態(tài)猝滅與溫度有關(guān)。(2)熒光壽命：靜態(tài)猝滅不因?yàn)殁鐒┑拇嬖诙绊憻晒夥肿蛹ぐl(fā)態(tài)的壽命，因而τ0/τ=1；動態(tài)猝滅因?yàn)殁鐒┑拇嬖诙篃晒鈮勖s短，此時(shí)τ0/τ=F0/F。(3)吸收光譜：靜態(tài)猝滅因形成分子復(fù)合物而使吸收光譜發(fā)生變化；動態(tài)猝滅不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜，只影響熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)采用Stern-Volmer方程進(jìn)行處理，以方便判斷猝滅類型，F(xiàn)0/F=1+KQτ0CQ=1+KsvCQ以F0/F對CQ作曲線圖(圖4)，數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

從圖4可以看出，F(xiàn)0/F對CQ呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且曲線的斜率隨著溫度的升高而逐漸降低，可判斷兩種小分子二氫黃酮醇與BSA結(jié)合形成了復(fù)合物，應(yīng)為靜態(tài)猝滅過程。

文獻(xiàn)[16]報(bào)道，各類猝滅劑對生物大分子的碰撞猝滅常數(shù)約為2×1010L·mol-1·s-1，熒光壽命約為1×10-8s。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，兩種小分子二氫黃酮醇對BSA的猝滅常數(shù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)，進(jìn)一步表明兩種二氫黃酮醇對BSA的猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

2.3結(jié)合常數(shù)的計(jì)算靜態(tài)猝滅過程中熒光強(qiáng)度F、猝滅劑濃度CQ和結(jié)合常數(shù)K之間的關(guān)系可用Line Weaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)表示：

(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1CQ-1

通過(F0-F)-1對CQ-1作曲線圖(圖5)，可求得二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA作用的結(jié)合常數(shù)，具體數(shù)據(jù)見表2。

從表2可以看出，溫度對二氫槲皮素及二氫楊梅素與BSA的結(jié)合常數(shù)K的影響不大，K的數(shù)值均大于104，說明BSA與兩種二氫黃酮結(jié)合較強(qiáng)，而相同的溫度下二氫楊梅素的結(jié)合常數(shù)K較大，可能與二氫楊梅素的結(jié)構(gòu)B環(huán)上多一個(gè)羥基有關(guān)，進(jìn)而說明黃酮中的羥基參與了結(jié)合反應(yīng)。

2.4作用力類型的確定不同藥物小分子與大分子蛋白質(zhì)的作用力類型主要有氫鍵、范德華力、疏水作用力和靜電引力等。如溫度變化不大，反應(yīng)焓變ΔH可看成常數(shù)，作用力類型可以通過反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔH和熵變ΔS的大小進(jìn)行判斷。藥物小分子與大分子BSA之間作用的熱力學(xué)參數(shù)可表示為：

lnK2/K1=ΔH(1/T1-1/T2)/R

ΔS=-(ΔG-ΔH)/T

ΔG=ΔH-TΔS

通過選定T1=293 K，T2=303 K計(jì)算其熱力學(xué)參數(shù)，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 BSA與二氫槲皮素和二氫楊梅素結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

從表3的熱力學(xué)數(shù)據(jù)來看，二氫槲皮素和二氫楊梅素的吉布斯自由能ΔG<0，說明兩種二氫黃酮與蛋白質(zhì)BSA的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的；ΔS>0，ΔH<0，說明兩者的結(jié)合力主要為疏水作用；二氫槲皮素和二氫楊梅素為多羥基類化合物，羥基將參與成鍵，因此除了疏水作用外，應(yīng)該還有氫鍵作用，兩種小分子物質(zhì)極有可能扦插到BSA中形成疏水空腔而使BSA的熒光發(fā)生猝滅。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)的研究表明，二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA之間存在相互作用并形成分子復(fù)合物，兩種小分子對BSA的熒光猝滅作用過程為靜態(tài)猝滅；根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)判斷，二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA作用主要是因?yàn)閮煞N小分子物質(zhì)扦插到BSA中后形成疏水空腔使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而出現(xiàn)熒光猝滅的靜態(tài)猝滅。

通過對二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA之間相互作用的研究，對于了解兩種小分子與BSA作用的機(jī)制，開發(fā)兩種小分子藥物及對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造有重要意義。