夏 蓉,周洪斌*,陶匯源

(1.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司,江蘇 鎮(zhèn)江 212021;2.國家食品添加劑及調(diào)味品檢測重點實驗室,江蘇 鎮(zhèn)江 212008)

恒順降脂醋膠囊是采用傳統(tǒng)固體發(fā)酵食醋,經(jīng)高倍濃縮成醋膏并添加其他天然成分制成的功能性保健食品。相關(guān)的研究表明,食醋能夠抑制膽固醇和甘油三酯水平的增高,具有降血脂作用[1-2];食醋中的黃酮類化合物可以減少動脈粥樣硬化的發(fā)生[3];恒順降脂醋膠囊中除了含有黃酮、多酚、有機酸、氨基酸等功效成分之外,還含有一定數(shù)量的不飽和脂肪酸。LEMKESL等[4]在對21～65周歲的健康男性和女性服用不飽和脂肪酸的研究中發(fā)現(xiàn),與不服用人群相比,服用α-亞麻酸類不飽和脂肪酸的人群可以顯著提高紅細(xì)胞中二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)的含量,減少心血管病的發(fā)生、降低心臟猝死的風(fēng)險。ODAE等[5]的研究也表明,服用不飽和脂肪酸可以大大降低冠狀動脈疾病的風(fēng)險。PARK Y等[6]的研究顯不,在人體腫瘤克隆細(xì)胞培養(yǎng)的過程中,添加共軛亞油酸可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡。還有的動物實驗資料顯不,ω-3和ω-6不飽和脂肪酸的同時服用可以防止老鼠眼壓升高引起的視網(wǎng)膜損傷[7]。

目前,不飽和脂肪酸的測定有多種方法[8]。ECKERL J等[9]用乙酰氯和甲醇對脂肪酸進行甲酯化,采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)的氣質(zhì)聯(lián)用儀(gaschromatograph-massspectrometry,GC-MS)快速檢測脂肪酸及其同分異構(gòu)體。JAEHOHA等[10]在反式脂肪酸的研究過程中,用二氯甲烷和甲醇的混合溶液提取待測組分,經(jīng)三氟化硼甲醇溶液甲酯化后用全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀測定黃油、牛油中的反式脂肪酸的含量;鄭月明等[11]也采用了類似的方法測定了植物油中31種脂肪酸。CZAUDERNA M等[12]采用非衍生化的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)的方法測定生物樣品中的共軛亞油酸及其同分異構(gòu)體。由于醋膠囊的基質(zhì)非常復(fù)雜,對于此類樣品,氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀(gaschromatography-triplequadrupolemass spectrometry,GC-MS/MS)在消除基質(zhì)干擾、縮短檢測時間方面具有一定的優(yōu)勢[13]。本研究先對油脂進行皂化,在脂肪酸硅烷化衍生[14]的基礎(chǔ)上,建立了醋膠囊中不飽和脂肪酸成分GC-MS/MS快速定性定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恒順降脂醋膠囊:鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司。

α-亞麻酸、γ-亞麻酸、亞油酸、油酸、共軛亞油酸:美國Sigma公司;甲醇、乙腈、正己烷、硅烷化試劑(色譜純):上海安譜公司;氫氧化劑(優(yōu)級純):上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A氣相色譜、Agilent 7000B GC/MSTriple Quand(MS/MS)、Agilent 7693自動進樣器:美國Agilent公司;XW-80A渦旋混合器:上海醫(yī)科大學(xué)儀廠;H-2050R高速冷凍離心機:長沙湘儀離心機儀器有限公司;Milli-Q超純水一體機:Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及衍生

(1)標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:準(zhǔn)確稱取16.0 mg油酸、65.6 mg亞油酸、56.0 mg α-亞麻酸、96.0 mg γ-亞麻酸、26.0 mg共軛亞油酸于100 mL棕色容量瓶中,加正己烷溶解、定容至刻度,-18℃保存。

(2)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:吸取上述各儲備液100μL于10mL玻璃離心管中,氮吹至干。加入600μL吡啶、400μL硅烷化試劑加蓋衍生(70℃、30 min)。冷卻后,以吡啶為溶劑,采取倍比稀釋的方式向低濃度配制,過有機相膜進樣,生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)混合標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取15.0 mg亞油酸于10mL棕色容量瓶中,加正己烷溶解定容至刻度;4.0mg共軛亞油酸于20 mL棕色容量瓶中,加正己烷溶解定容至刻度。分別吸取亞油酸、共軛亞油酸1.0 mL于另一個10 mL棕色容量瓶中,再分別加入γ-亞麻酸、油酸、α-亞麻酸儲備液1 042μL、3 125μL、893μL,加正己烷溶解定容至刻度,-18℃保存。

1.3.2 原始樣品的前處理及衍生化

取膠囊20粒,用剪刀將頂部剪出一個小口將膠囊擠入10 mL燒杯中,攪拌均勻。準(zhǔn)確稱取(100±0.2)mg醋膠囊于10 mL離心管中,加2 mL氫氧化鉀-甲醇(1 mol/L)溶液皂化(70℃、30 min),冷卻后加入1.5 mL稀鹽酸(10%)中和剩余的堿。加7 mL正己烷渦旋3 min,5 000 r/min(4℃)離心20 min,取上清液于50 mL容量瓶中。再重復(fù)正己烷提取程序兩次后,用正己烷定容。取50μL正己烷層,加入550μL吡啶、400μL硅烷化試劑加蓋衍生(70℃、30 min)。冷卻至室溫過有機相膜備測。

1.3.3 加標(biāo)樣品的前處理

按照1.3.1部分稱取樣品,各加入100μL、200μL混合加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液,氮吹至正己烷層消失,渦旋3 min。以下按照1.3.2部分樣品的前處理及衍生化方法執(zhí)行,再補加2.0 mL吡啶,渦旋,過有機相膜備測。

1.3.4 GC-MS/MS條件

(1)GC條件

DB-5MS毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm);載氣為氦氣(He)(純度99.999%),流速1.0mL/min;進樣量1.0μL,不分流進樣;進樣口溫度280℃;程序升溫條件:初始溫度160℃保持1 min,以10℃/min升至200℃保持2 min,以5℃/min升至235℃不保持,以25℃/min升至300℃保持0.4 min。

(2)MS/MS條件

溶劑延時:10 min;離子化模式:電子電離(electron ionization,EI);電離能量70eV;離子源溫度230℃;GC-MS/MS接口溫度280℃;多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(multiple-reaction monitoring,MRM);5種脂肪酸保留時間和特征離子、碰撞能量等參數(shù)見表1;5種脂肪酸衍生物總離子流色譜圖見圖1。

表1 5種脂肪酸保留時間和特征離子、碰撞能量參數(shù)Table1 Retention times,characteristic ions and the collision energy parameters of five kinds of fatty acids

圖1 5種脂肪酸總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of five kinds of fatty acids

2 結(jié)果與分析

2.1 皂化溶液的酸化

油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、共軛亞油酸在油脂產(chǎn)品中大多數(shù)是以酯的形式存在的,直接用GC-MS/MS測定比較困難,一般需要皂化將酯變成羧酸鉀后再提取出來測定。樣品提取液酸化和不酸化的比較結(jié)果見圖2。

圖2 樣品提取液酸化和不酸化的比較Fig.2 Comparison of sample extracting solution before and after acidification

由圖2可知,用同一濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)溶液進行加標(biāo)回收實驗,皂化后加入鹽酸溶液酸化,讓脂肪酸徹底游離,有利于正己烷溶劑的提取,回收率和重復(fù)性都顯著改善。

2.2 分子離子的選擇

由圖1可知,上述5種脂肪酸硅烷化衍生物分子離子峰附近,均可以找到從分子離子上打掉一個甲基的峰(表2),這種峰的響應(yīng)值比分子離子峰的值要高。在本研究的過程中,對這兩種離子能量碰撞后的響應(yīng)值和離子碎片進行了考察。以共軛亞油酸為例:在分離離子峰(351.8m/z)左側(cè)有一個較大的碎片離子(336.2 m/z)(圖3)。通過查找碎片離子可以發(fā)現(xiàn),351.8 m/z離子打碎后的響應(yīng)值比336.2 m/z的高很多(圖4);而且前者的碎片離子中高質(zhì)荷比的離子數(shù)量要多(圖4),因此,盡管打掉一個甲基的峰在全掃描模式下顯得比分子離子峰高,但是選擇這種離子來進行系統(tǒng)實驗不太合適。其他4種脂肪酸的分子離子峰的質(zhì)荷比分別為γ-亞麻酸(350.2 m/z)、亞油酸(351.8 m/z)、油酸(354 m/z)、α-亞麻酸(350 m/z)。

表2 各組分的分子離子質(zhì)荷比以及去掉一個甲基的質(zhì)荷比Table2 Mass-to-charge ratio of molecular,ion and taking out a methyl of components

圖3 全掃描模式下共軛亞油酸提取離子質(zhì)譜圖Fig.3 Extracted ions mass spectrum of conjugated linoleic acid under full scan mode

圖4 351.8 m/z、336.2 m/z碎片離子的總離子流圖(a)及質(zhì)譜圖(b,c)Fig.4 Total ion chromatogram(a)and mass spectrum(b,c)of fragment ion with 351.8 m/z and 336.2 m/z

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系

在1.3.4優(yōu)化實驗條件下,以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、以待測組分含量(x)為橫坐標(biāo)進行線性回歸,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 5種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系Table3 Linear relationships for standard curves of five kinds of fatty acids

2.3.2 加標(biāo)回收率、精密度、檢出限及定量限

按照1.3.2部分的方法加標(biāo)、提取、測定,對所建立的方法進行檢測。檢測結(jié)果見表4。

表4 5種脂肪酸加標(biāo)回收率、精密度實驗結(jié)果及檢出限和定量限Table4 The adding standard recovery rate,precision,limit of detection and limit of quantitation of five kinds of fatty acids

由表4可知,油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、共軛亞油酸的檢出限(信噪比S/N=3)分別為0.052%、0.17%、0.15%、0.25%、0.061%;定量限(S/N=10)分別為0.17%、0.57%、0.50%、0.82%、0.20%。5種脂肪酸的回收率為75.0%～103.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為2.3%～6.6%。該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合相關(guān)的技術(shù)要求,適用于醋膠囊中脂肪酸含量的檢測。

3 結(jié)論

本實驗采用皂化、酸化、硅烷化技術(shù),建立了一種簡單、快速、準(zhǔn)確的測定恒順降脂醋膠囊中脂肪酸GC-MS/MS的方法。該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合相關(guān)的技術(shù)要求,適用于醋軟膠囊中脂肪酸的檢測。