伍 強,彭娟娟,余有貴,萬 常,肖長元,王美麗

(1.邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽 422000;2.邵陽市釀酒工程技術(shù)研究中心,湖南 邵陽 422000)

大湘西涵蓋湘西土家族苗族自治州、懷化市及邵陽、永州的部分縣市等湖南西部地區(qū),氣候溫和,雨量充沛,適宜野生獼猴桃(Actinidia chinensis)生長[1]。野生獼猴桃具有較高的營養(yǎng)價值,適合老人、兒童及孕婦食用[2]。目前,獼猴桃果酒通常采用安琪酵母、葡萄酒酵母等商業(yè)酵母進(jìn)行釀造[3-4],由于缺乏更適合獼猴桃發(fā)酵的專用菌種和成熟的發(fā)酵技術(shù),該果酒在色、香、味等品質(zhì)上并不理想[5],且不同產(chǎn)地或品種的獼猴桃所釀造的果酒品質(zhì)差別較大[6]。為提高果酒品質(zhì),國內(nèi)外學(xué)者通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗及分子生物學(xué)鑒定等手段已分離篩選出適于果酒發(fā)酵的野生酵母菌,但近年來國內(nèi)對獼猴桃果酒的野生酵母菌研究尤為關(guān)注[7-12]。羅安偉等[8]篩選獲得3株酵母菌,菌株YZ1產(chǎn)酒精度為9.4%vol,其發(fā)酵最適pH為4.5,但未研究其耐高溫、耐乙醇等性能;郝瑤等[9]通過分離、顯微鏡觀察、WL培養(yǎng)基篩選和鑒定,確定發(fā)酵能力較好的菌株Y-41為庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichia kudriavzevii),該菌株在pH為3.0～4.5范圍內(nèi)生長代謝良好,當(dāng)酒精度＞12%vol時受到嚴(yán)重抑制;徐清萍等[11]分離篩選獲得1株發(fā)酵能力好、耐受性強的酵母菌,耐酒精度為12%vol,耐糖度為150 g/L,在pH 2.0～4.0范圍內(nèi)能生長,但未進(jìn)一步鑒定該菌株種屬。大湘西是我國獼猴桃第二大產(chǎn)地,尤其在邵陽地區(qū)資源豐富,目前未見大湘西野生獼猴桃酵母菌的相關(guān)報道。

因此,本研究以大湘西野生獼猴桃為菌種分離源,通過分離純化、鑒定和耐酒精度、pH、耐高溫、耐糖濃度等發(fā)酵性能試驗,篩選耐受性較強并適用于獼猴桃果酒發(fā)酵的優(yōu)勢野生酵母菌,為開發(fā)大湘西野生獼猴桃釀酒酵母資源提供前期技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

野生獼猴桃:邵陽市綏寧縣金水灣生態(tài)現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)不范園。

1.1.2 試劑

安琪果酒酵母:安琪酵母股份有限公司;果膠酶(50000U/g):寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammoniumbromide,CTAB)、蛋白酶K(30 U/g)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction,PCR)緩沖液、脫氧核糖核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate,dNTP):北京寶杰羅生物科技有限公司。實驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基[13]采用酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptonedextrose,YEPD)培養(yǎng)基,115℃滅菌30 min;WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[14]:高溫121℃滅菌20 min;獼猴桃培養(yǎng)基:選八成熟、發(fā)軟的野生獼猴桃,清洗干凈,去皮打漿,然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%果膠酶攪拌均勻,35℃酶解3 h。取上清液于三角瓶中,68℃水浴處理(滅菌)20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

101-2AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱:天津市泰斯特儀器有限公司;SW-CJ-1FD型單人單面垂直凈化工作臺:蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司;BA310型數(shù)碼顯微鏡:麥克奧迪(廈門)實業(yè)集團有限公司;JYL-C012型打漿機:九陽股份有限公司;EL20型pH計:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-1780型紫外可見分光光度計:日本島津儀器有限公司;JI54DWS型高壓滅菌鍋:致微(廈門)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 野生獼猴桃果肉中酵母菌的初步分類

無菌條件下稱取10 g新鮮的野生獼猴桃果肉于無菌研缽中研成果漿,轉(zhuǎn)移至裝有90 mL無菌水的三角瓶,混合均勻后靜置15 min。以無菌水對漿液進(jìn)行梯度稀釋,吸取10-1稀釋液2μL涂布于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)5 d后,根據(jù)菌落形態(tài)及顏色進(jìn)行初步分類[14]。

1.3.2 野生獼猴桃果肉中酵母菌的分離篩選及純化

吸取野生獼猴桃10-1稀釋液2μL涂布于YEPD平板培養(yǎng)基上,于28℃培養(yǎng)3 d。挑選典型的酵母單菌落平板劃線繼代2次獲得純化菌種。將純化菌種劃線接種于YEPD斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)2 d,待菌落生成后,直立放置于4℃保存。

將上述純化菌株接種于YEPD液體培養(yǎng)基,28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置24h進(jìn)行活化,調(diào)整種子液濃度為1.0×108CFU/mL,以3%接種量(V/V)接種于裝液量為200 mL/500 mL獼猴桃培養(yǎng)基中,在無菌條件下用檸檬酸鈉將pH調(diào)整為3.8,并用棉塞和保鮮膜對三角瓶進(jìn)行密封,于28℃靜置發(fā)酵48 h,觀察其發(fā)酵現(xiàn)象,并記錄起酵時間,選取氣泡生成較多、具有典型酒香生成的菌株做進(jìn)一步研究[15]。

1.3.3 野生獼猴桃果肉中酵母菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定[14,16]:將上述篩選獲得的酵母菌株分別劃線接種于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)5d后,觀察菌落形態(tài)及顏色。結(jié)合WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分類結(jié)果,對該酵母菌進(jìn)行鏡檢,于油鏡下觀察每株酵母菌的細(xì)胞形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定[17]:提取分離篩選獲得的酵母菌的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),以其為模板進(jìn)行PCR擴增,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)采用引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進(jìn)行PCR擴增,其它酵母則采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增條件為:95℃、10 min;95℃、30 s,55℃、30s,70℃、1min,35個循環(huán);72℃、10min。PCR擴增體系:雙蒸水(ddH2O)17.8μL,Buffer(Mg2+Plus)3μL,dNTP(25 mmol/L)2μL,NL1/ITS1(10 mmol/L)3μL;NL4/ITS4(10 mmol/L)3μL;DNA模板1μL,Taq酶(5 U/L)0.2μL。將PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測序,并在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比對,采用MEGA.6.0軟件的鄰近法(neighbor joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 野生獼猴桃果肉中酵母菌的耐受性研究

以安琪果酒專用酵母為對照,采用杜氏管發(fā)酵法[15]對酵母菌進(jìn)行發(fā)酵,酵母菌種子液濃度為1.0×108CFU/mL,以3%接種量(V/V)將酵母菌種子液接種于乙醇、pH、糖及溫度等各脅迫條件下的獼猴桃培養(yǎng)基,于28℃靜置發(fā)酵3 d,分別觀察并記錄酵母細(xì)胞在不同乙醇濃度(4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、12%vol)、pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)、糖質(zhì)量濃度(150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L)、發(fā)酵溫度(26℃、28℃、30℃、33℃、37℃)條件下的產(chǎn)氣情況。根據(jù)產(chǎn)氣充滿杜氏管時間分為0～5級,0級:不產(chǎn)氣;1級:72 h時產(chǎn)氣充滿杜氏管;2級:60 h時產(chǎn)氣充滿杜氏管;3級:48 h時產(chǎn)氣充滿杜氏管;4級:36 h時產(chǎn)氣充滿杜氏管;5級:24 h時產(chǎn)氣充滿杜氏管。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生獼猴桃果肉中酵母菌的初步分類

野生獼猴桃中酵母菌較為豐富,徐清萍等[11]利用WL培養(yǎng)基顏色變化和顯微鏡觀察,從河南平頂山野生獼猴桃鮮果中共初篩出136株酵母菌。王榮榮等[18]以獼猴桃果肉為原料,利用WL培養(yǎng)基觀測形態(tài)、杜氏管發(fā)酵,篩選獲得釀造獼猴桃酒的優(yōu)良酵母。為探究大湘西野生獼猴桃果肉中酵母菌的種類,并篩選鑒定出發(fā)酵性能優(yōu)良的獼猴桃果酒酵母,將野生獼猴桃果漿涂布于YEPD培養(yǎng)基和WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng),觀察酵母形態(tài)特征。酵母菌菌群在YEPD培養(yǎng)基和WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的菌落生長情況見圖1。

圖1 野生獼猴桃果肉中酵母菌群在YEPD培養(yǎng)基(A)和WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(B)上的生長情況Fig.1 Growth situation of yeasts from wild kiwifruit pulpa on YEPD medium(A)and WL nutrient agar medium(B)

由圖1A可知,參照楊瑩等[19]的分類方法,野生獼猴桃果肉中酵母菌群至少可分成6類,分別為克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri):白色,邊緣有不規(guī)則小突起;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae):乳白色,表面光滑不透明、平板上有酒香;紅酵母(Rhodotorula sp.):紅色,球形突起、表面光滑黏稠、呈黃油狀;葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum):中央深綠色、邊緣淡綠色,扁平、表面光滑不透明、呈黃油狀;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyccspombe):深綠色,菌落很小、表面光滑不透明、呈黃油狀;全美梅氏酵母(Metschnikowia pulcherrima):紅棕色,菌落小、表面突起不透明等。因此,大湘西野生獼猴桃果肉中酵母菌的種類可能包含畢赤酵母、釀酒酵母、紅酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、粟酒裂殖酵母和全美梅氏酵母6類酵母。

2.2 野生獼猴桃果肉中酵母菌的分離篩選

從YEPD培養(yǎng)基上隨機挑取30株菌種作進(jìn)一步分離純化,分別編號為JM1～JM30,并利用獼猴桃培養(yǎng)基發(fā)酵性能試驗對30株酵母菌進(jìn)行篩選。在釀酒過程中若釀酒酵母起酵太慢,野生酵母菌、霉菌和細(xì)菌等將會迅速生長代謝,進(jìn)而可能抑制釀酒酵母的生長代謝,造成獼猴桃果酒風(fēng)味缺陷甚至使發(fā)酵液發(fā)酵滯緩。為縮短獼猴桃果酒的發(fā)酵周期,選擇能在48 h之內(nèi)快速啟動發(fā)酵的酵母菌株。研究發(fā)現(xiàn),分離純化獲得的30株野生獼猴桃酵母菌中JM1、JM11、JM12菌株的起酵時間均能在48 h之內(nèi)快速啟動發(fā)酵。因此,初步確定JM1、JM11、JM12為發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌。

2.3 野生獼猴桃果肉中酵母菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:酵母菌JM1、JM11、JM12的細(xì)胞形態(tài)及在YEPD和WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)結(jié)果見圖2。

由圖2可知,菌株JM1、JM11、JM12在YEPD培養(yǎng)基上具有不同的菌落形態(tài)特征,其中菌株JM11、JM12菌落為白色,菌株JM1菌落為乳白色,但菌落較小。菌株JM1與JM11、JM12在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及顏色差異并不明顯,三者均呈白色。其中,菌株JM11與JM12菌落表面光滑不透明,且平板上有酒香。鏡檢結(jié)果顯不菌株JM1、JM11、JM12均與酵母細(xì)胞形態(tài)相似,呈圓形或橢圓形。

圖2 野生獼猴桃果肉中酵母菌的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Colony and cell morphology of yeasts from wild kiwifruit pulpa

分子生物學(xué)鑒定:為進(jìn)一步鑒定分離篩選獲得的野生酵母菌JM1、JM11、JM12的種屬,利用引物對NL1/NL4對菌株JM11和JM12的基因序列進(jìn)行PCR擴增,采用引物對ITS1/ITS4對菌株JM1的基因序列進(jìn)行PCR擴增,采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證,結(jié)果如圖3所不。

圖3 野生獼猴桃果肉中酵母菌JM1、JM11和JM12的PCR擴增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification products of yeasts JM1,JM11 and JM12 from wild kiwifruit pulpa

由圖3可知,菌株JM1擴增產(chǎn)物的堿基長度約為580bp,菌株JM11和JM12擴增產(chǎn)物的堿基長度均約為550 bp。將所得序列提交至GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對,選取同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖4。

圖4 菌株JM1、JM11和JM12的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains JM1,JM11 and JM12

由圖4可知,菌株JM1與克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)和庫德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)聚于一支,序列的相似性為99%,而菌株JM11和JM12與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)聚于一支,親緣關(guān)系較近。結(jié)合菌株的菌落特征和細(xì)胞形態(tài)觀察,鑒定所篩選的野生獼猴桃酵母菌JM1可能為克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)或庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii),菌株JM11和JM12為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)?？唆斁S畢赤酵母常用于生產(chǎn)乙酸戊二酯等香味物質(zhì)[20],釀酒酵母是果酒發(fā)酵最重要的微生物[21],在調(diào)味劑、發(fā)酵食品等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 野生獼猴桃果肉中酵母菌的耐受性研究

采用杜氏管發(fā)酵法研究酵母菌JM1、JM11和JM12在不同乙醇濃度、pH、糖濃度和溫度下的產(chǎn)氣情況,根據(jù)各菌株發(fā)酵使杜氏管充滿CO2的時間判斷其在各脅迫環(huán)境下的發(fā)酵能力,以安琪果酒專用酵母為對照(Control),耐受性試驗結(jié)果如圖5所不。

釀酒酵母對高酒精含量的耐受性是釀酒酵母的重要特征,酒精耐受性強能使其發(fā)酵徹底,大大提高獼猴桃酒的酒精度[22]。由圖5(A)可知,相較于安琪果酒專用酵母,野生酵母JM1、JM11和JM12都能耐受高濃度乙醇。其中,菌株JM12對乙醇的耐受性最高,在乙醇含量為12%vol時,產(chǎn)氣48 h充滿杜氏管,而菌株JM11次之(產(chǎn)氣60 h充滿杜氏管),菌株JM1的乙醇耐受性最差,但仍能在含12%vol乙醇濃度的發(fā)酵基質(zhì)中發(fā)酵產(chǎn)氣。

野生獼猴桃富含有機酸、維生素C(vitamin C,VC)等營養(yǎng)成分,口味偏酸,應(yīng)篩選出耐酸的釀酒酵母菌用于野生獼猴桃果酒釀造[23]。由圖5(B)可知,3株野生獼猴桃酵母均能耐受pH＜3.5的發(fā)酵基質(zhì)。其中,菌株JM1的耐pH最好,當(dāng)pH＞3.0時,均在24 h內(nèi)快速產(chǎn)氣充滿杜氏管,甚至優(yōu)于安琪果酒專用酵母。菌株JM11次之(產(chǎn)氣60h充滿杜氏管),但仍可在pH 2.5條件下發(fā)酵產(chǎn)氣。菌株JM12耐pH最差,在pH 3.0左右不能發(fā)酵產(chǎn)氣。

在葡萄酒工業(yè)中,糖是果酒發(fā)酵的基礎(chǔ),也是酵母的能量來源[24]。由圖5(C)可知,耐糖性能強弱排序為菌株JM11＞JM12＞JM1,當(dāng)糖含量為300 g/L時,分別在產(chǎn)氣48 h、60 h和72h時充滿杜氏管,菌株JM11和JM12均能耐受350 g/L的糖含量;在糖含量為250 g/L時,菌株JM1和JM12的產(chǎn)氣量最多,說明這2株野生酵母菌在糖含量為250 g/L時生長狀況最好,但在糖含量為300 g/L時,菌株JM11產(chǎn)氣情況優(yōu)于菌株JM12。

圖5 野生獼猴桃果肉中優(yōu)良酵母菌的乙醇(A)、pH(B)、糖(C)和溫度(D)耐受性試驗Fig.5 Tolerance tests of dominant yeasts from wild kiwifruit pulp on alcohol(A),p H(B),sugar(C)and temperature(D)

南方偏高溫天氣居多,發(fā)酵設(shè)備安裝保溫系統(tǒng)成本較高,篩選出適于果酒釀制的耐高溫酵母菌株能避免發(fā)酵中止等問題[25]。由圖5(D)可知,菌株JM1、JM11和JM12的最適發(fā)酵溫度均為28℃,菌株JM1和JM12在33℃時仍可產(chǎn)氣;菌株JM11耐高溫特性則更強,高達(dá)37℃。

菌株JM11的乙醇、糖、低pH和高溫耐受性具有明顯優(yōu)勢,尤其在糖含量達(dá)350 g/L仍可產(chǎn)氣,耐高溫37℃。菌株JM12耐乙醇特性雖優(yōu)于菌株JM1和JM11,耐高溫達(dá)33℃,但其低pH耐受性最差,pH 3.0左右便停止產(chǎn)氣,而菌株JM1和JM11均能耐受pH＜2.5的發(fā)酵基質(zhì)。菌株JM1雖低pH耐受性強于菌株JM11和JM12,但耐糖和耐乙醇特性均為最差。綜合考慮,菌株JM11為適用于獼猴桃果酒發(fā)酵的優(yōu)勢野生釀酒酵母。

3 結(jié)論

通過對野生獼猴桃果肉中優(yōu)良酵母菌的分離篩選及分子生物學(xué)鑒定,獲得3株野生酵母菌,經(jīng)鑒定JM1可能為克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)或庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii),菌株JM11和JM12均為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。耐受性試驗結(jié)果表明,菌株JM11的乙醇、糖、pH和高溫耐受性具有明顯優(yōu)勢,尤其在糖含量高達(dá)350 g/L、高溫37℃、pH低至2.5,乙醇含量為12%vol時仍可產(chǎn)氣,可作為獼猴桃果酒發(fā)酵的優(yōu)勢酵母菌。