張 勇,郭棟豪,王克勤,武小芬,齊 慧,鄧 明,陳 亮*

(1.湖南省農(nóng)業(yè)科學院 湖南省核農(nóng)學與航天育種研究所,湖南 長沙 410125;2.湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙 410125;3.湖南大學 隆平分院,湖南 長沙 410125)

我國是農(nóng)業(yè)大國,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年都產(chǎn)生數(shù)量豐富的秸稈生物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計,2016年全國農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量為8.16億t,其中玉米秸稈的產(chǎn)量最大,占總量的36.88%[1]。目前秸稈綜合利用水平和效率還比較低,主要集中在肥料化、燃料化、飼料化方面。隨著經(jīng)濟與社會的發(fā)展,秸稈的傳統(tǒng)利用方式在逐漸萎縮,秸稈資源處于嚴重相對過剩狀態(tài),秸稈露天焚燒事件屢見不鮮,給生態(tài)環(huán)境帶來巨大壓力,因此為秸稈利用尋求新的途徑迫在眉睫。

與此同時,在傳統(tǒng)化石能源日益枯竭的背景下,將數(shù)量巨大的秸稈類木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能源越來越引起人們的興趣[2]。很多國家從20世紀70年代左右就已經(jīng)開始了以可再生資源作為補充替代能源的研究[3]。預處理是秸稈等木質(zhì)纖維素煉制生物質(zhì)能源的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸之一。有效的預處理能破壞秸稈的物理化學結(jié)構(gòu),有助于提高秸稈的轉(zhuǎn)化效率,但同時增加預處理工序又會提高生產(chǎn)成本,還可能因為預處理過程使用的酸堿化合物而造成環(huán)境污染,因此能否達到多方面的平衡成為評價預處理方法是否可行的重要依據(jù)。γ射線輻照是一種很有特色木質(zhì)纖維素的預處理手段,與常見的預處理方法比較,秸稈在輻照預處理時無需水的參與,也不需要添加酸堿等化合物,因此無環(huán)境污染的顧慮,并且輻照處理過程是在常溫下進行,因此能耗低,最關(guān)鍵的是經(jīng)過輻照處理后,秸稈的糖化效率可以數(shù)倍的提高[4-5]。但是關(guān)于輻照預處理木質(zhì)纖維素的研究大多集中在酶解糖化階段[6-7],對后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)乙醇工藝研究較少。因此,以γ射線輻照為預處理手段,探討玉米秸稈酶解發(fā)酵產(chǎn)乙醇的一些基本問題,可以為玉米秸稈煉制燃料乙醇提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈:2016年10月采集于湖南省作物研究所試驗田。

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(china center of industrial culture collection,CICC)31014。

香草酸、丁香酸、香草醛、對香豆酸(均為色譜純):德國Sigma公司;甲酸、乙酸、糠醛、對羥基苯甲酸、4-羥基苯甲醛、無水葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖、乙腈、甲醇、無水乙醇、硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、硼氫化鈉、硫酸、磷酸氫二銨、無水氯化鈣、氫氧化鈣、氫氧化鈉(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;酵母粉(生化試劑):廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;纖維素酶(40FPU/mL):Novozymes公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基:硫酸銨2 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、無水硫酸鎂1 g/L、無水氯化鈣0.2 g/L、酵母粉5 g/L;pH≈6(碳源為玉米秸稈)。121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

60Co-γ輻照裝置:湖南省核農(nóng)學與航天育種研究所;Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC):賽默飛世爾科技(中國)有限公司;TG16-Ⅱ臺式高速離心機:長沙平凡儀器儀表有限公司;YXQ-LS-50S11壓力蒸汽滅菌器:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;HZQ-F100恒溫搖床:常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米秸稈輻照處理

玉米秸稈在60℃條件下烘干,切成5 cm左右的小段,裝入金屬樣品盒,于室溫條件下用60Co-γ射線進行輻照預處理,輻照劑量率為1.25 kGy/h。

1.3.2 玉米秸稈脫毒處理與發(fā)酵

脫毒處理:分別稱取吸收劑量約800 kGy、絕干質(zhì)量為10 g的輻照玉米秸稈粉于250 mL的具塞錐形瓶中,分三組分別加入100 mL去離子水、100mL氫氧化鈣溶液(pH=11)、100 mL 20 mmol/L硼氫化鈉溶液,然后置于恒溫搖床中,37℃、150 r/min條件下處理2 h,結(jié)束后取出過濾。

乙醇發(fā)酵:取100 mL發(fā)酵專用具塞錐形瓶,分別加入1.5 g的上述3種脫毒處理所得樣品濾渣,滅菌后加入27 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,再按20 FPU/g固體加入纖維素酶,最后加入3 mL種子培養(yǎng)液,置于恒溫搖床中,37℃、150 r/min條件下進行同步糖化發(fā)酵(simultaneous saccharification and fer mentation,SSF)。

1.3.3 玉米秸稈在不同工藝條件下的乙醇發(fā)酵

玉米秸稈的酶解:向錐形瓶中加入pH 5.0左右的發(fā)酵培養(yǎng)基45 mL和吸收劑量約800 kGy、絕干質(zhì)量為5 g的輻照玉米秸稈粉,置于高壓滅菌鍋中,121℃滅菌20 min,冷卻后按20 FPU/g固體加入纖維素酶。

玉米秸稈的發(fā)酵:同步糖化發(fā)酵,在加入纖維素酶時同步加入釀酒酵母,發(fā)酵溫度為37℃;分步糖化發(fā)酵(sepa rate hydrolysis and fermentation,SHF)則是在50℃振蕩酶解48 h后再接入釀酒酵母,發(fā)酵溫度為37℃;變溫同步糖化發(fā)酵(nonisothennal simultaneous saccharitlcation and fermentation,NSSF)是在加入纖維素酶時同步加入釀酒酵母,于37℃條件下發(fā)酵,期間每發(fā)酵12h便將溫度升至42℃保持20 min,之后在37℃條件下繼續(xù)發(fā)酵,如此反復直至發(fā)酵結(jié)束;半同步糖化發(fā)酵(hemi simultaneous saccharification and fermentation,HSSF)是在50℃條件下酶解12 h后再接入釀酒酵母發(fā)酵,發(fā)酵溫度為37℃。所有發(fā)酵實驗的酵母接種量均為10%。

1.3.4 測定方法

木質(zhì)纖維素含量:按照參考文獻[8]的方法進行測定;纖維素酶酶活:按照參考文獻[9]的方法進行測定;單糖、乙醇含量:按照參考文獻[10]的方法進行測定;抑制物含量:按照參考文獻[11]的方法進行測定。

乙醇轉(zhuǎn)化率按下式計算:

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻照處理強度對玉米秸稈化學及物理性質(zhì)的影響

表1 輻照對玉米秸稈主要化學組分的影響Table1 Effect of irradiation on main chemical constituents of corn straw

從表1可以看出,玉米秸稈經(jīng)過輻照后,3種主要化學組分的含量都不同程度的降低,說明γ射線對玉米秸稈的3種主要化學組分都有降解作用,且在實驗范圍內(nèi),3種組分含量與輻照強度呈負相關(guān),說明輻照強度越大,這3種化學組分降解越嚴重,孫豐波[12]在用γ射線輻照竹材時也發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象,本課題組之前在研究γ射線輻照對水稻秸稈化學組分時還發(fā)現(xiàn)輻照在降低水稻秸稈木質(zhì)纖維素含量的同時會使秸稈的可溶性糖大幅度提高[13],因此輻照后玉米秸稈纖維素、半纖維素含量的大幅度降低并不意味著糖的大量損失,而可能意味著大分子的纖維素、半纖維素被降解成較低分子量的糖;3種化學組分對輻照的敏感程度不一,木質(zhì)素含量變化最小,說明對輻照最穩(wěn)定,半纖維素含量變化最大,說明最容易被降解,這可能與其化學結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān),木質(zhì)素是由苯環(huán)類化合物組成,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,因此難降解,而半纖維素屬于雜多糖,且側(cè)鏈較多,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差,因此容易被降解[14]。

玉米秸稈經(jīng)不同輻照劑量處理后表觀結(jié)構(gòu)的變化情況見圖1。

圖1 輻照對玉米秸稈表觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of irradiation on apparent structure of corn straw

從圖1可以看出,未經(jīng)輻照的玉米秸稈表觀結(jié)構(gòu)相對平滑、完整,輻照后的玉米秸稈微觀結(jié)構(gòu)變的粗糙多孔,說明輻照對玉米秸稈的微觀結(jié)構(gòu)有明顯的破壞作用,在水稻、芒草、蘆葦秸稈中發(fā)現(xiàn)過類似現(xiàn)象[13,15-16]。這種疏松多孔結(jié)構(gòu)增加了玉米秸稈的表面積,有利于秸稈生物煉制過程中酶與底物接觸,提高酶解轉(zhuǎn)化效率。

2.2 不同脫毒處理對輻照玉米秸稈乙醇發(fā)酵的影響

由于預處理是將木質(zhì)纖維素原有物理化學結(jié)構(gòu)破壞并重組的過程,因此不可避免的會生成新化合物,其中就包括抑制發(fā)酵的物質(zhì),并且預處理方式、原料種類對抑制物的生成都有影響[17]。經(jīng)過輻照處理的玉米秸稈在水洗、氫氧化鈣和硼氫化鈉脫毒處理后,脫毒濾液中部分抑制物的濃度情況見表2,濾液中抑制物含量越高,則殘渣中抑制物含量越小,脫毒處理對抑制物脫除效果越好。

有機酸是木質(zhì)纖維輻照處理過程中最常見的副產(chǎn)物,也是一類常見的發(fā)酵抑制物,由表2可知,氫氧化鈣處理對甲酸的脫除效果最佳,約為水處理的2.5倍;氫氧化鈣和硼氫化鈉對乙酸脫除效果相當,都明顯優(yōu)于水處理,對于其他有機酸,除對香豆酸外,3種處理差別不是非常明顯;而對于另一種強發(fā)酵抑制物糠醛,氫氧化鈣和硼氫化鈉處理的脫除率約為水的2倍,但是3種處理液中糠醛的含量都不高,可能是木質(zhì)纖維素輻照過程中糠醛生成量較少的原因。

表2 不同脫毒處理對脫除抑制物效果的影響Table2 Effect of different detoxification treatments on detoxification inhibitors effect

圖2 不同脫毒處理對輻照玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of different detoxification treatments on ethanol conversion rate of irradiated corn straw

由圖2可知,三種脫毒方式處理后發(fā)酵72 h時乙醇轉(zhuǎn)化率均基本達到最大值。三種脫毒處理玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率大小順序為:硼氫化鈉處理(73.6%)＞氫氧化鈣處理(70.8%)＞水洗(66.7%),均顯著高于未脫毒處理玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率(56.0%)(P＜0.05)。因此,脫毒處理對提高輻照玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率有明顯作用。

2.3 不同發(fā)酵工藝對輻照玉米秸稈乙醇發(fā)酵影響

圖3 不同發(fā)酵工藝對輻照玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of different fermentation processes on ethanol conversion rate of irradiated corn straw

由于不同預處理方法的作用原理及作用效果都不相同,加上不同原料的化學成分、物理性質(zhì)也不相同,因此可能導致后續(xù)的酶解發(fā)酵工藝可能需要根據(jù)實際情況進行優(yōu)化[18],選擇合適的酶解發(fā)酵工藝是工藝條件優(yōu)化的第一步。由圖3可知,經(jīng)過輻照的玉米秸稈都能發(fā)酵獲得乙醇,并且發(fā)酵24h后乙醇轉(zhuǎn)化率都接近或達到最大值,發(fā)酵完成時間和單糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇時間相當,發(fā)酵效率比較高,主要原因是秸稈中大分子纖維素和半纖維素在輻照后已經(jīng)被降解成小分子多糖,多糖水解為單糖的速率大大加快;SHF、NSSF、HSSF和SSF的乙醇轉(zhuǎn)化率分別為41.9%、41.9%、39.6%和55.9%,可以看出前3種工藝的乙醇轉(zhuǎn)化率差異不大,而SSF獲得的乙醇轉(zhuǎn)化率較另外3種工藝高,說明對于玉米秸稈而言,SSF與輻照預處理的適配性比較好。

3 結(jié)論

本實驗對射線輻照處理玉米秸稈進行了發(fā)酵產(chǎn)乙醇研究,發(fā)現(xiàn)γ射線輻照能破壞玉米秸稈物理化學結(jié)構(gòu),但同時發(fā)現(xiàn)在輻照后的玉米秸稈中存在甲酸、乙酸、糠醛、對羥基苯甲酸、四羥基苯甲醛、對香豆酸等發(fā)酵抑制物,脫毒處理能降低抑制物濃度并顯著提高乙醇轉(zhuǎn)化率(P＜0.05),其中硼氫化鈉脫毒后的玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率最高,為73.6%;初步研究了發(fā)酵工藝與輻照預處理的適配性,發(fā)現(xiàn)SSF與γ射線輻照預處理的玉米秸稈適配性最好,該工藝下輻照玉米秸稈乙醇轉(zhuǎn)化率為55.9%。