任丹丹，夏媛媛，王秀男，劉 彪，李 強，沈際佳，張玉俠

在我國血吸蟲病仍是一個重大公共衛(wèi)生問題，嚴重影響社會經濟發(fā)展[1-2]。其主要危害是肝臟的蟲卵性肉芽腫炎癥和隨后的纖維化[3]。肝臟肉芽腫細胞的分離、純化和檢測對研究蟲卵肉芽腫的細胞學及免疫學機制至關重要。

有相關文獻中報道采用Ⅳ型膠原酶結合注射器機械吹打分離肉芽腫細胞，但并未提供詳細的實驗步驟，而且尚無針對感染不通過階段(急、慢性期)分離肉芽腫細胞的優(yōu)化方案[4-7]。本研究結合國內外相關文獻報道，采用Ⅳ型膠原酶兩步消化法處理急、慢性血吸蟲感染小鼠肝臟，通過流式檢測肉芽腫細胞的主要成分以確定分離效果以獲得大量的及保存細胞表面標志物的肉芽腫細胞為標準。對膠原酶濃度及消化時間進行調整，建立了分離急慢性肉芽腫細胞的有效方法。

1 材料與方法

1.1日本血吸蟲感染模型的建立 C57BL/6，6-8周齡的SPF級雄性小鼠購自南京模式動物研究所。日本血吸蟲陽性釘螺購自湖南省寄生蟲病防治研究所，以常規(guī)方法逸出尾蚴。C57/BL6小鼠腹部去毛，蓋玻片蘸取尾蚴(20±2條)貼于小鼠腹部。感染后6周或12周處死小鼠。

1.2 肝臟肉芽腫細胞的分離

1.2.1脫頸處死小鼠后， 75%乙醇浸泡 3 min，無菌取出約1 g的肝臟放入青霉素瓶中。

1.2.2加入100 μL下述不同濃度的Ⅳ型膠原酶溶液，眼科剪剪碎肝組織呈糊狀(約10 min)。

1.2.35 mL的生理鹽水重懸剪碎的肝組織，待肉芽腫顆粒自然下沉即吸去渾濁上清，再加入生理鹽水重懸，并吸去上清，如此反復自然沉淀洗滌，直至上清清澈。

1.2.4收集感染6周的肉芽腫顆粒加入50 mL錐形瓶中：再分別加入10 mL含Ca2+/Mg2+和5%的胎牛血清的0.5 mg/mL、0.25 mg/mL和0.2 mg/mL的膠原酶溶液(Ⅳ型Solarbio)，37 ℃搖床消化，210 r/min，30 min；300目細胞篩過濾，小鐵勺刮取細胞篩上的肉芽腫放入新錐形瓶中，再分別加入10 mL的上述濃度膠原酶溶液，37 ℃搖床消化，210 r/min，30 min。

1.2.5將雛形瓶置于冰上3 min終止消化，倒入無菌皿中，加入適量的完全1640培養(yǎng)基，用5 mL注射器反復吹，直至肉芽腫顆粒消失，300目細胞篩過濾至50 mL離心管中，離心，1 500 r/min，5 min，4 ℃。

1.2.6棄上清，加入5 mL紅細胞裂解液，冰上10 min，再加入10 mL的不完全1640終止裂紅，上下顛倒離心管混勻。離心，1 500 r/min，5 min，4 ℃，棄上清。不完全1640培養(yǎng)基離心洗滌2次，1 mL完全1640培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度為4×106～6×106個/mL，400目尼龍網(wǎng)過濾懸液以去除蟲卵，用于流式檢測。

1.2.7膠原酶消化時間和濃度的調整：感染6周小鼠肝臟，先固定消化時間不變(兩步消化時間為30/30 min)，改變膠原酶濃度(分別為0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL)，37 ℃搖床，210 r/min進行消化，獲取肉芽腫細胞，標記抗體進行流式檢測，結果表明0.25 mg/mL為最佳濃度。然后選擇0.25 mg/mL膠原酶濃度來設置不同的消化時間分別為30 min與30 min、40 min與20 min和30 min與20 min，并據(jù)流式結果確定最佳消化時間，感染12周小鼠肝臟，分別采用0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的酶溶液消化，兩次時間為40 min與30 min。

1.3流式細胞術檢測肉芽腫細胞 肉芽腫細胞5×106個/管，大鼠血清20 μL，室溫封閉20 min。加入1 μL FITC-CD4抗體/管(BD公司)，4 ℃，避光孵育40 min。染色緩沖液洗滌，350 μL的流式固定液重懸、固定細胞。流式儀檢測。

1.4天狼猩紅染色 留取肝臟組織，4%的多聚甲醛溶液固定24 h，浸臘、包埋，切片厚度5 μm，脫蠟至水,做常規(guī)天狼猩紅染色。

1.5數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0 軟件包處理, 三組數(shù)據(jù)比較采用方差分析, 兩組間比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1肝臟的大體圖 感染6周的小鼠肝臟表面可見很多粟粒樣肉芽腫顆粒如圖1A，而感染12周的小鼠肝臟表面肉芽腫顆粒較多但較小，且肝臟顏色更深，呈深褐色見圖1B。

A. 感染6周； B. 感染12周圖1 小鼠感染血吸蟲后病變肝臟Fig.1 Photography of livers in mice infected with S. japonicum

2.2肝臟纖維化觀察 紅色為天狼猩紅所染的纖維化組織，感染6周的小鼠肝臟肉芽腫見圖2A，此時肝臟纖維化程度輕、面積較??；感染12周的肝臟，纖維化面積增大見圖2B。

A. 感染6周； B. 感染12周圖2 小鼠感染血吸蟲后的肝臟纖維化(天狼猩紅染色, ×100)Fig.2 Hepatic fibrosis in mice infected with S. japonicum (Sirius red staining, ×100)

2.3獲得干凈的肝臟肉芽腫及肉芽腫細胞 如圖3A、B所示，第一步膠原酶消化后獲得干凈的肉芽腫。鏡下可見大量圍繞蟲卵的肉芽腫細胞如圖3B。經過第二步膠原酶消化后獲得干凈的活肉芽腫細胞見圖3C。

A. 肉芽腫顆粒； B. 肉芽腫顆粒鏡下圖(×200)； C. 肉芽腫細胞(×400)圖3 肝臟肉芽腫顆粒及肉芽腫細胞Fig.3 Hepatic granulomatous granules and cells

2.4 流式檢測肉芽腫細胞

2.4.1 感染6周的肝臟肉芽腫

2.4.1.1膠原酶濃度的探索 分別采用0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL Ⅳ型膠原酶進行消化，消化時間均為30 min /30 min，獲取肉芽腫細胞，標記抗體后進行流式檢測。結果表明，0.25 mg/mL酶溶液消化下，可獲得較高比例的CD4+T細胞且CD4+T細胞分群明顯如圖4A、B。統(tǒng)計結果見圖4C, *P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。因此，選擇膠原酶最佳濃度為 0.25 mg/mL，用于探索消化時間。

圖4 不同膠原酶濃度分離感染6周肝臟肉芽腫細胞的效果Fig.4 Effects of different collagenase concentrations on the isolation of hepatic granuloma cells from 6-week infection livers

2.4.1.2消化時間的優(yōu)化 在確定膠原酶最佳濃度為0.25 mg/mL后，調整消化時間為：30 min /30 min，30 min /20 min，40 min /20 min，粒細胞和淋巴細胞流式圖見圖5A。結果表明，在使用0.25 mg/mL的Ⅳ型膠原酶濃度條件下，第一次消化時間為30 min，第二次消化時間為20 min時，CD4+T細胞分群最佳，但細胞比例較低，見圖5B；當?shù)谝淮蜗瘯r間增加至40 min時，可獲得更多CD4+T細胞，但CD4+T細胞分群不明顯，見圖5C；而當兩次消化均為30 min時，可獲得數(shù)量較多且分群明顯的CD4+T細胞。

圖5 不同消化時間分離感染6周肝臟肉芽腫細胞的效果Fig.5 Effects of different digestion periods on the isolation of hepatic granuloma cells from 6-week infection livers

2.4.2流式檢測感染12周小鼠肝臟肉芽腫細胞的分離效果 血吸蟲感染小鼠隨著病情進展，肝臟逐漸出現(xiàn)纖維化，由于大量膠原沉積，此時分離肉芽腫細胞應該使用更高濃度的酶消化液，消化時間也應適當延長。再分離急性肉芽腫細胞得所獲結果基礎上，分別采用0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的Ⅳ型膠原酶消化，第一次消化時間40 min，第二次消化時間30 min的條件下，粒細胞和淋巴細胞流式圖見圖6A。使用0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶溶液，最終分離所獲的CD4+T細胞難以分群，見圖6B；且不獲得更多的淋巴細胞，見圖6C。因此，濃度為0.3 mg/mL的Ⅳ型膠原酶分離感染后12周肝臟肉芽腫細胞效果較好。由于已獲得較為滿意的分離效果，對于消化時間未做其它調整。

圖6 不同膠原酶濃度消化分離感染12周肝臟肉芽腫細胞的效果Fig.6 Effects of different collagenase concentrations on the isolation of hepatic granuloma cells from 12-week infection livers

3 討 論

宿主感染血吸蟲后，機體會逐漸產生一系列的免疫防御反應，CD4+T細胞具有重要作用，CD4+T細胞分化的Th1、Th2、Treg和Th17等細胞在血吸蟲感染后的不同階段參與免疫應答，分泌的細胞因子相互調控參與機體免疫應答[8]。在血吸蟲感染動物模型中，早期主要形成Th1型免疫應答[9]，晚期會轉化，以Th2型細胞因子為主的免疫應答環(huán)境[10-11]；而Treg細胞已被證明可使血吸蟲感染由急性轉為慢性感染[12-13]；Th17細胞參與了蟲卵導致的急性肉芽腫和肝纖維化，而且IL-17和IFN-γ在血吸蟲感染過程中相互調節(jié)[14-16]。因此，獲得足量、純凈的肝臟肉芽腫活細胞，特別是細胞表面標志保存完整的CD4+T細胞對于血吸蟲性肝臟疾病的細胞學的研究至關重要。

Pellegrino等采用勻漿機破碎肝臟，然后生理鹽水反復洗滌、自然沉淀的方法獲得肉芽腫組織，缺點是肉芽腫上仍附著有肝組織[17]；Ragheb等采用上述方法獲得肉芽腫組織后，采用Ⅳ型膠原酶和DNase I在37 ℃水浴搖床消化肉芽腫顆粒30～50 min分離曼氏血吸蟲感染8周和20周的CBA/J小鼠[4]。Metwali等采用0.5%的Ⅳ型膠原酶37 ℃水浴搖床消化30～40 min分離曼氏血吸蟲感染8周CBA/J小鼠的肝臟肉芽腫細胞[18-19]。以上這些分離肉芽腫細胞的方法存在不同的缺陷：如肉芽腫細胞不純(含有肝漿)；或是細胞表面標志丟失；或是細胞的活性降低影響后續(xù)實驗。

研究表明日本血吸蟲與曼氏血吸蟲治病力不同，如曼氏血吸蟲感染C57BL/6小鼠僅產生較小的肝臟肉芽腫，而感染CBA/J小鼠則發(fā)生強烈的肉芽腫反應，程度與日本血吸蟲感染的C57BL/6小鼠相似，因而上述關于曼氏血吸蟲肉芽腫細胞分離方法不適用于分離日本血吸蟲肉芽腫細胞。本研究在Yole[20]建立的Ⅳ型膠原酶兩步消化法分離肉芽腫細胞的基礎上，對膠原酶濃度和消化時間進行探索，建立了針對日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠急、慢性肝臟肉芽腫細胞分離的有效方法。通過第一步膠原酶消化，去除了肉芽腫周圍的肝組織，過濾后得到了干凈的肉芽腫顆粒；通過第二步膠原酶消化和注射器機械吹打，有效地分散了組成肉芽腫的各種細胞。

感染6周的小鼠肝臟肉芽腫細胞流式檢測的結果顯示，稍高的膠原酶濃度或者過久的消化，都會導致CD4+T細胞分群不明顯，而過低的膠原酶濃度也無法分離出足夠CD4+T細胞，所以對于感染了6周小鼠的肝臟，建議采用0.25 mg/mL的膠原酶消化液，兩步消化時間為30 min/30 min，此時CD4+T細胞比例高且細胞分群明顯。隨著感染時間的推移，肝臟肉芽腫炎癥由急性感染轉化為慢性感染并伴隨有肝纖維化，肝臟的膠原含量會逐漸增多(天狼星紅染色結果可見)，因此，需要改變膠原酶濃度和消化時間。結果表明：分離感染12周的小鼠肝臟肉芽腫細胞最佳膠原酶濃度為0.3 mg/mL的酶濃度，分離的CD4+T細胞比例較高，且分群明顯；而使用0.5 mg/mL的膠原酶濃度則會破壞CD4+T細胞表面蛋白，且細胞分群不明顯。

本研究提供的分離肉芽腫細胞的方法可重復性好，步驟簡單易操作；整個過程不超過2 h；不需要淋巴細胞分離液等試劑輔助純化；可以包括粒細胞在內的組成肉芽腫的主要細胞群；而且細胞純度高、活性好(臺盼藍染色細胞活性達95%)，獲得肉芽腫細胞，完全可以滿足后續(xù)實驗(如刺激培養(yǎng)、流式分選等)的要求?？蓮V泛地用于日本血吸蟲肝臟肉芽腫疾病的細胞免疫研究，特別是為進一步研究肉芽腫細胞中的Th1、Th2、Th17和Treg等輔助性T細胞的提供了一種可靠的CD4+T細胞分離技術。