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血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康、阻礙疫區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病，是世界衛(wèi)生組織確定的六大熱帶病之一[1-2]。目前我國人畜血吸蟲感染率和感染強(qiáng)度已明顯下降，絕大部分流行區(qū)已達(dá)到傳播控制目標(biāo)，但由于日本血吸蟲宿主多，釘螺分布面積廣，尚不能從根本上阻斷血吸蟲病的流行和傳播[3-4]。DNA疫苗是將編碼特異性抗原的基因重組到真核表達(dá)載體，注入機(jī)體后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的一類疫苗，具有制備簡易，免疫原性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。研究表明多價(jià)DNA疫苗的免疫保護(hù)力優(yōu)于單件DNA疫苗[5]。本實(shí)驗(yàn)室彭微等分別從SIEA 26-28kDa和AWA 31-32kDa中克隆出來日本血吸蟲核糖體蛋白S4(SjRPS4)與組織內(nèi)肽酶B(SjCB)，將其構(gòu)建為pVAX1/SjRPS4·CB雙價(jià)DNA疫苗，該疫苗具有良好的抗日本血吸蟲病免疫保護(hù)效果[6-7]。

細(xì)胞因子是機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣泛生物學(xué)活性的異質(zhì)性肽類調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、損傷組織修復(fù)等多種功能。白細(xì)胞介素-18 (IL-18)是一種具有重要的免疫調(diào)節(jié)和免疫保護(hù)功能的細(xì)胞因子[8]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-18具有免疫佐劑效應(yīng)，可顯著增強(qiáng)各種抗原的免疫原性，從而明顯提高疫苗接種的效果[9-10]。傳統(tǒng)的細(xì)胞因子免疫是體外直接供給細(xì)胞因子，維持時(shí)間短，所需量大。如以質(zhì)粒為載體，將細(xì)胞因子作為基因佐劑接種機(jī)體，可減少細(xì)胞因子制備、純化等過程。鑒于此，本研究選用pVAX1/IL-18 聯(lián)合pVAX1/SjRPS4·CB疫苗進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以探討pVAX1/IL-18對(duì)日本血吸蟲DNA疫苗效果的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 質(zhì)粒pVAX1/SjRPS4·CB、pVAX1/IL-18、pVAX1，SjCB蛋白和SjRPS4蛋白，由湘雅醫(yī)學(xué)院寄生蟲病學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備保存；羊抗鼠IgG-HRP、二氨基苯胺(DAB)均為Sigma公司產(chǎn)品；IL-18 ELISA檢測(cè)試劑盒為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Babl/c小鼠，雌性，體重18g～25g，6周齡，購自湖北市疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部；陽性釘螺系本室釘螺實(shí)驗(yàn)基地提供。

1.3動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方案 將BALB/C小鼠隨機(jī)分為NS組、pVAX1空質(zhì)粒組、pVAX1/IL-18組、pVAX1/SjRPS4·CB組、pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組，每組12只。每組小鼠在左后腿股四頭肌注射相對(duì)應(yīng)質(zhì)粒100 μg或者等劑量生理鹽水，隔2周加強(qiáng)1次，共注射3次。末次免疫3周后，經(jīng)腹部皮膚感染20±1只日本血吸蟲尾蚴。感染后8W解剖小鼠。

1.4pVAX1/SjRPS4·CB免疫學(xué)活性鑒定 將純化的SjCB蛋白和SjRPS4蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以實(shí)驗(yàn)小鼠血清作為一抗，以抗鼠IgG-HRP(1∶2 000)作為二抗，二氨基苯胺(DAB)作為底物進(jìn)行顯示觀察。

1.5小鼠血清IL-18和抗體IgG的檢測(cè) 于小鼠末次免疫后3W斷尾法取血，收集小鼠血清。血清以1∶200-1∶25 600倍比稀釋，用間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠IgG抗體。采用康為世紀(jì)IL-18 ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-18在各組小鼠血清中的含量。

1.6減蟲率和減卵率 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用頸椎脫臼法處死小鼠，采取左心室-門靜脈灌注法收集成蟲，計(jì)算減蟲率；將雌蟲夾在兩片載玻片中，輕輕按壓后顯微鏡下計(jì)數(shù)雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)。取0.5 g肝臟、腸組織，剪碎，與5%KOH溶液37 ℃水浴5～6 h后，取500 μL懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵數(shù)，計(jì)算每克肝蟲卵數(shù)(LEPG)和每克腸蟲卵數(shù)(IEPG)。按下列公式計(jì)算減蟲率和減卵率。

2 結(jié) 果

2.1重組蛋白SjRPS4、SjCB的免疫學(xué)活性檢查 Western Blotting結(jié)果顯示分別在50 kD左右及32 kD左右處出現(xiàn)陽性條帶(圖1)，表明SjCB與SjRPS4蛋白均可同小鼠陽性血清結(jié)合，說明高效重組質(zhì)粒pVAX1/SjRPS4·CB構(gòu)建表達(dá)成功，重組蛋白具有良好的抗原性。

M：protein marker；1：SjCB與陽性小鼠血清共孵育；2：SjRPS4與陽性小鼠血清共孵育M:protein marker; 1：SjCB incubated with Serum of pVAX1/SjRPS4·CB vaccine and pVAX1/IL-18 group;2：SjRPS4ncubated with Serum of pVAX1/SjRPS4·CB vaccine and pVAX1/IL-18 group圖1 重組蛋白SjCB與SjRPS4的Western blotting分析Fig.1 Western blotting analysis of recombinant SjCB and SjRPS4

2.2血清中IL-18的檢測(cè) ELISA檢測(cè)各組小鼠血清中的IL-18細(xì)胞因子的水平，發(fā)現(xiàn)pVAX1/IL-18組和pVAX1/SjRPS4·CB + pVAX1/IL-18組小鼠血清中的IL-18細(xì)胞因子的水平較pVAX1/SjRPS4·CB或pVAX1空質(zhì)粒對(duì)照組顯著升高(圖2)，表明pVAX1/IL-18質(zhì)?？稍谛∈篌w內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。

* P<0.05,與NS或pVAX1組比較* P<0.05, vs, NS or pVAX1圖2 ELISA檢測(cè)小鼠血清中IL-18結(jié)果Fig.2 IL-18 levels in serum of mice by ELISA

2.3血清中IgG 抗體的檢測(cè) 末次免疫3周后斷尾取血，將血清以1∶200-1∶25 600倍比稀釋，按OD450值的比值P/N>2.1 作陽性為標(biāo)準(zhǔn)，得到pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組的抗體滴度為1∶12 800，高于pVAX1/SjRPS4·CB組滴度1∶6 400。血清稀釋度為1∶200的情況下，pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組和pVAX1/SjRPS4·CB組的IgG 抗體OD450值分別為1.03±0.17和0.82±0.15高于其他組(P<0.05)，但pVAX1/SjRPS4·CB組與pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組IgG 抗體水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.4小鼠減蟲率及減卵率 pVAX1/SjRPS4·CB組減蟲率、肝組織減卵率和腸減卵率分別為36%、52%、50%，pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組減蟲率、肝組織減卵率和腸減卵率分別為52%、63%、67%(表1)，兩組減蟲率、肝組織減卵率和腸減卵率與NS或pVAX1組比較具有顯著增加，其兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠減蟲率及減卵率
Tab.1 Worm and egg reduction rates of mice in each group

組別Group平均檢獲成蟲數(shù)(條)Mean No. of worms(x±s)減蟲率Worm reduction rates(%)平均LEPGMean LEPG(x±s)肝減卵率Liver egg reduction rate (%)平均 IEPGMean IEPG (x±s)腸減卵率Intestine egg reduction rate(%)NS15.00±0.94-11925.33±1357.18-13491.89±1983.60-pVAX114.40±1.17411662.89±1825.73212528.67±2152.487pVAX1/IL-1812.30±0.82*188756.11±1069.45*2710106.11±1286.49*25pVAX1/SjRPS4·CB9.60±0.97*365680.22±917.50*526746.33±793.53*50pVAX1/SjRPS4·CB+ pVAX1/IL-187.20±0.79*#524383.00±772.96*#634500.22±604.52*#67

*P<0.05,與NS或pVAX1組比較；#P<0.05,與pVAX1/SjRPS4·CB組比較

*P<0.05, vs, NS or pVAX1；#P<0.05, vs, pVAX1/SjRPS4·CB

2.5每雌減卵率 采取左心室-門靜脈灌注法收集成蟲，將雌蟲夾在兩片載玻片中，輕輕按壓后顯微鏡下計(jì)雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)，按公式計(jì)算每雌減卵率。由表2可知，pVAX1/IL-18，pVAX1/SjRPS4·CB， pVAX1/SjRPS4·CB+ pVAX1/IL-18組每雌減卵率分別為7%、36%、52%；pVAX1/SjRPS4·CB+ pVAX1/IL-18組每雌減卵率與其他組相比，減卵效果明顯(P<0.05)。

表2 血吸蟲雌蟲減卵率
Tab.2 The egg reduction rate of per female worm

組別Group雌蟲數(shù)量(條)No. of female worm平均每雌蟲卵數(shù)(個(gè))Mean eggs per female worm(x±s)每雌減卵率Egg reduction rate(%)NS10171.00±12.94-pVAX110162.90±14.765pVAX1/IL-1810158.40±10.097pVAX1/SjRPS4·CB10109.90±7.36* 36pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-181081.50±6.52*#52

*P<0.05,與NS或pVAX1組比較；#P<0.05,與pVAX1/SjRPS4·CB組比較

*P<0.05, vs, NS or pVAX1；#P<0.05, vs, pVAX1/SjRPS4·CB

3 討 論

隨著對(duì)佐劑作用機(jī)制的研究，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)中各類細(xì)胞及細(xì)胞因子的深入研究，疫苗佐劑的研制也進(jìn)入了高速發(fā)展期。細(xì)胞因子有著廣泛的生物學(xué)活性，具有免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)和增強(qiáng)DNA 疫苗的免疫反應(yīng)，是作為疫苗佐劑的理想選擇[11-13]。IL-18是IL-1細(xì)胞因子超家族中的一員，主要作用于T細(xì)胞、NK細(xì)胞，誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)IFN-γ和IL-12的產(chǎn)生，不僅在抗感染、抗腫瘤方面有重要作用，也參與自身免疫性疾病等多種疾病的病理過程[14-15]。IL-18在日本血吸蟲病的免疫保護(hù)、抗病效果等方面也取得了顯著的效果。Zhang等[16]將IL-18基因修飾的肝細(xì)胞經(jīng)脾移植入感染血吸蟲的小鼠，IL-18增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)，起到抗纖維化的作用。因此，IL-18成為佐劑研究，特別是作為高效血吸蟲病疫苗佐劑研究的熱點(diǎn)之一[17]。

本研究利用pVAX1/SjRPS4·CB、pVAX1/IL-18聯(lián)合免疫Babl/c小鼠，結(jié)果顯示，pVAX1/SjRPS4·CB+pVAX1/IL-18組減蟲率、肝減卵率、腸減卵率和每雌減卵率均高于疫苗組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示pVAX1/IL-18對(duì)血吸蟲疫苗pVAX1/SjRPS4·CB有較明顯的增效作用。Dupré等[18]在使用IL-18作為佐劑與疫苗共同免疫BALB/c小鼠后，小鼠減蟲率與減卵率分別為23%和28%。Men等[19]構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1/mIL-18和pVAX1/Sj23聯(lián)合免疫小鼠，小鼠成蟲減蟲率和減卵率明顯高于單獨(dú)免疫組，并且可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的IgG，提示pVAX1/mIL-18和pVAX1/Sj23聯(lián)合免疫小鼠具有一定的增效作用。本研究也發(fā)現(xiàn)疫苗免疫小鼠后，pVAX1/SjRPS4·CB +pVAX1/IL-18組誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG 抗體水平明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，證明IL-18質(zhì)粒促進(jìn)了特異性抗體的產(chǎn)生，從而促進(jìn)宿主產(chǎn)生了明顯的減蟲和減卵效果。

總之，IL-18作為佐劑在抗寄生蟲方面有重要的作用，與一些疫苗聯(lián)合免疫后可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)力，但仍需要進(jìn)一步深入研究其在免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制。