傅嘉敏,劉騰飛,韓曉陽(yáng)
(l. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 泰安 271018;2. 山東省果樹研究所,山東 泰安 271000)
2017年山東省茶園面積已達(dá)2.7×104hm2,茶產(chǎn)業(yè)在推動(dòng)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略、發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟(jì)等方面發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)為了滿足市場(chǎng)需求,茶農(nóng)在管理過(guò)程中施用大量化肥,影響土壤環(huán)境,降低茶葉品質(zhì),對(duì)茶葉品質(zhì)安全及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全造成嚴(yán)重威脅[1]。針對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上施肥用藥不科學(xué)、不合理現(xiàn)象,國(guó)家制定了“雙減”項(xiàng)目,通過(guò)推進(jìn)減肥減藥,逐步改善土壤理化環(huán)境,以提高農(nóng)作物品質(zhì)。因此,具有特殊功能性的新型菌肥是未來(lái)農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向。
幾丁質(zhì)廣泛存在于甲殼類動(dòng)物的外殼、昆蟲的甲殼和真菌的胞壁中[2],其在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等方面應(yīng)用十分廣闊,主要是通過(guò)微生物分泌幾丁質(zhì)酶來(lái)進(jìn)行降解[3]。目前,在細(xì)菌、真菌、放線菌中都發(fā)現(xiàn)許多具有降解幾丁質(zhì)功能的菌株,譬如環(huán)狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、紅色鏈霉菌、米曲霉等[4-9]。滕少輝等[10]篩選出一株幾丁質(zhì)降解菌,經(jīng)鑒定為鞘氨醇單胞菌。該菌能有效抑制番茄枯萎病菌,對(duì)水稻根系發(fā)育有較好的促生作用。Mavingui等[11]發(fā)現(xiàn)一株具有幾丁質(zhì)酶活性的多粘類芽孢桿菌,該菌能夠有效抑制根部和種苗病害。張立陽(yáng)等[12]從玉米秸稈中分離出一株枯草芽孢桿菌,它對(duì)卷枝毛霉、尖孢鐮刀菌、米曲霉、黑曲霉的生長(zhǎng)具有抑制作用。閆海洋等[13]篩選出一株幾丁質(zhì)降解菌,它對(duì)玉米的生物學(xué)性狀及產(chǎn)量表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用,增產(chǎn)達(dá)13.08%。
本試驗(yàn)擬從山東茶園土壤中篩選出具有降解幾丁質(zhì)功能的菌株,并通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)、生理生化、16S rDNA序列的研究,確定菌株的種屬,進(jìn)而對(duì)菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究,為深入研究幾丁質(zhì)的生物降解及菌劑的開發(fā)提供菌種支持。
1.1.1 土樣采集 2017年7月采集山東農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園基地土壤,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的篩選。
1.1.2 培養(yǎng)基 幾丁質(zhì)培養(yǎng)基[14]:蛋白胨10 g,K2HPO40.7 g,MgSO40.5 g,KH2PO40.3 g,膠體幾丁質(zhì)5.0 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0。
篩選培養(yǎng)基:膠體幾丁質(zhì)20 g,Na2HPO42 g,KH2PO41 g,NaCl 0.5 g,NH4Cl 1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl2·2H2O 0.5 g,酵母粉0.5 g,瓊脂15~20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0。
LB培養(yǎng)基:NaCl 10 g,酵母膏5 g,蛋白胨10 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0。
1.2.1 菌株的初篩 無(wú)菌環(huán)境下稱取土壤樣品,采用梯度稀釋法[15],在分離培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株的初篩。將初篩后的菌株進(jìn)行保存,供后續(xù)試驗(yàn)使用。
1.2.2 菌株的復(fù)篩 將初選得到的菌株制備種子液。按照4%的比例將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7 d后進(jìn)行酶活檢測(cè)復(fù)篩[16]。每個(gè)菌株做3次重復(fù)測(cè)定。
1.2.3 菌落形態(tài)及生理生化鑒定 將菌株點(diǎn)接在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)7 d,肉眼觀察菌落形態(tài)并作好記錄。參考細(xì)菌手冊(cè)[17,18]進(jìn)行生理生化鑒定。
1.2.4 分子鑒定 采用細(xì)菌DNA試劑盒提取菌株總DNA。采用細(xì)菌16S通用引物(16S-27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;16S-1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT),并參照文獻(xiàn)[19]的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體中,進(jìn)行測(cè)序。登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行菌株序列的比對(duì),并構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,分析菌株的親緣關(guān)系。
1.2.5 SDS-PAGE蛋白聚類 首先將菌株進(jìn)行富集培養(yǎng),然后離心,加入緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解。采用聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行電泳分離。閱讀PAGE膠上條帶信息,對(duì)菌株進(jìn)行聚類分析[20,21]。
1.2.6 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 菌株首先接種于液體種子培養(yǎng)基中,28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD=0.05;將種子液按照4%的接種量接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵條件試驗(yàn)。
(1)pH值對(duì)幾丁質(zhì)降解菌產(chǎn)酶能力的影響試驗(yàn):設(shè)定pH值為5、6、7、8,溫度為25℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,設(shè)置3個(gè)重復(fù),置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3 d,采用DNS法測(cè)定酶活性。
(2)溫度對(duì)幾丁質(zhì)降解菌產(chǎn)酶能力的影響試驗(yàn):設(shè)定溫度分別為15、20、25、30、35、40℃六個(gè)處理,pH值均為7.0,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,培養(yǎng)時(shí)間2~3 d ,采用DNS法測(cè)定酶活性。
(3) 轉(zhuǎn)速對(duì)幾丁質(zhì)降解菌產(chǎn)酶能力的影響試驗(yàn):設(shè)定轉(zhuǎn)速為140、160、180、200 r/min,pH值均為7.0,溫度30℃,同樣設(shè)置3個(gè)重復(fù),置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3 d,采用DNS法測(cè)定酶活性。
(4) 混合菌對(duì)幾丁質(zhì)降解菌產(chǎn)酶能力的影響試驗(yàn):將J4和J17菌株分別培養(yǎng)至菌液OD=0.05,將J4與J17按照1∶1的比例接種4%于培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn),與J4菌株和J17菌株單獨(dú)培養(yǎng)的產(chǎn)酶能力做比較,采用DNS法測(cè)定酶活性。
數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS軟件進(jìn)行方差分析,采用Mirosoft Excel 2010 作圖。
2.1.1 初篩 本試驗(yàn)從土壤中分離出20株菌株,并編號(hào)為J1—J20(見(jiàn)表1)。經(jīng)透明圈法篩選出4株幾丁質(zhì)降解菌菌株,分別為J4、J15、J17、J19。
表1 菌株初篩結(jié)果
注:“-”為無(wú)脫色圈出現(xiàn)。
2.1.2 復(fù)篩 (1) 菌株酶活測(cè)定:由表2可以看出,J4、J17、J19 3株菌產(chǎn)酶能力存在顯著差異。其中J4菌株酶活最高,可達(dá)49.31 U/mL,顯著高于J17和J19,J17顯著高于J19。
(2) 菌株聚類 SDS-PAGE:細(xì)胞蛋白電泳可將細(xì)菌從蛋白水平上進(jìn)行區(qū)分。由圖1可見(jiàn),菌株J4、J17和J19被分成2大類群。菌株J17、J19屬于類群Ⅰ,J4屬于類群Ⅱ,說(shuō)明菌株J17與J19有可能屬于同一種屬。
綜上分析,本試驗(yàn)選擇J4和J17作為終選菌株,并做進(jìn)一步鑒定及產(chǎn)酶特性研究。
表2 菌株酶活結(jié)果
圖1 幾丁質(zhì)降解菌全細(xì)胞蛋白電泳圖譜(a)及聚類分析樹形圖(b)
2.2.1 菌落形態(tài)鑒定 由圖2可見(jiàn),J4菌落為淡黃色圓形,其表面光滑,邊緣整齊,不透明,菌落呈凸起狀。J17菌落為乳白色橢圓形,其表面褶皺,邊緣不整齊,不透明,菌落呈凸起狀。
圖2 菌落形態(tài)
2.2.2 菌株生理生化鑒定 菌株J4為革蘭氏陰性菌,好氧,V-P陽(yáng)性,可利用N-乙酰葡萄糖胺、阿拉伯糖、纖維二糖、蔗糖、葡萄糖,脲酶為陰性,能水解淀粉。菌株J17為革蘭氏陽(yáng)性菌,好氧,接觸酶陽(yáng)性,V-P陽(yáng)性,可利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖,能水解淀粉。
2.2.3 菌株分子鑒定 經(jīng)測(cè)序檢測(cè),菌株J4和J17的序列長(zhǎng)度為1 400 bp和1 420 bp。將所得序列進(jìn)行 BLAST 比對(duì),結(jié)果表明,J4屬于鞘氨醇桿菌屬,J17屬于芽孢桿菌屬。從菌株系統(tǒng)發(fā)育樹可知(圖 3),菌株J4與Sphignobacterium親緣關(guān)系最近,菌株J17與Bacillus親緣關(guān)系最近。
圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
2.3.1 pH值對(duì)終選菌株產(chǎn)酶能力的影響 由圖4a可知,J4、J17菌株隨pH值的升高,酶活增加,在pH值7.0時(shí)有較高的產(chǎn)酶能力,酶活可達(dá)4.31 U/mL和4.34 U/mL,高于或低于pH值 7.0時(shí)酶活均有不同程度的下降。表明pH值7.0為J4、J17菌株產(chǎn)酶的最適pH值。
2.3.2 溫度對(duì)終選菌株產(chǎn)酶能力的影響 由圖4b可知,溫度影響著菌株的產(chǎn)酶能力。隨著溫度升高,菌株J4的產(chǎn)酶能力呈直線上升,在30℃時(shí)達(dá)到最高,之后出現(xiàn)下降,表明在30℃下J4的產(chǎn)酶能力最高。菌株J17在15~20℃產(chǎn)酶能力變化不大,20~25℃產(chǎn)酶能力迅速提升,在25℃時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶能力的最高點(diǎn)。
2.3.3 轉(zhuǎn)速對(duì)終選菌株產(chǎn)酶能力的影響 由圖4c可知,菌株J4隨轉(zhuǎn)速增加,產(chǎn)酶能力有不同程度的增加,在200 r/min時(shí)酶活最高;菌株J17隨轉(zhuǎn)速增加產(chǎn)酶能力不斷增加,在180 r/min時(shí)酶活達(dá)最高值,之后酶活下降。因此,J4菌株的最適轉(zhuǎn)速為200 r/min,J17菌株最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。
2.3.4 混合菌株對(duì)幾丁質(zhì)產(chǎn)酶能力的影響 由表3可以看出,J4+J17混合菌株產(chǎn)酶能力與J4、J17單菌株產(chǎn)酶能力相比差異顯著,分別高出9%和23%。說(shuō)明兩菌株混合后產(chǎn)酶能力得到提升。
表3 混合菌株對(duì)幾丁質(zhì)產(chǎn)酶能力的影響
幾丁質(zhì)廣泛存在于自然界中,所降解產(chǎn)物對(duì)病害的抑制和植株的生長(zhǎng)發(fā)育,具有良好的促進(jìn)作用。滕少輝等[10]篩選出一株幾丁質(zhì)降解菌,經(jīng)鑒定為鞘氨醇單胞菌。Mavingui[11]和張立陽(yáng)[12]等分別發(fā)現(xiàn)了具有幾丁質(zhì)酶活性的高效菌株,經(jīng)鑒定均屬于芽孢桿菌屬,這些菌株對(duì)病害的防治以及植株的生長(zhǎng)都有良好的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)從山東茶園土壤中篩選出具有幾丁質(zhì)降解功能的菌株J4和J17。通過(guò)形態(tài)鑒定、生理生化鑒定和分子鑒定,發(fā)現(xiàn)J4和J17分別屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphignobacterium)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。本研究得到的菌株與前人從自然界中篩選到的結(jié)果有一致性,說(shuō)明這兩個(gè)屬中普遍存在著具有幾丁質(zhì)降解功能的菌株。
前人從自然界中篩選到諸多具有幾丁質(zhì)降解功能的菌株,從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,各菌株的產(chǎn)酶能力存在較大差別。張立陽(yáng)等[12]篩選到的Bacillussubtilis,幾丁質(zhì)降解酶活可達(dá)3.23 U/mL;孫菽蔚等[22]篩選到的Pseudoaltermonas,酶活可達(dá)116.2 U/mL;王海東等[16]篩選到的Aeromonashydrophlilla,產(chǎn)酶條件優(yōu)化后酶活可達(dá)0.39 U/mL。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)J4和J17產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了菌株J4在pH 值7.0、溫度30℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng),其產(chǎn)酶活性達(dá)到最高。菌株J17在pH值 7.0、溫度25℃~30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng),其產(chǎn)酶活性達(dá)到最高。兩株最高酶活分別可達(dá)5.43 U/mL和4.80 U/mL。試驗(yàn)結(jié)果與前人有較大差別,有可能與菌株存在的環(huán)境、分離篩選所用的底物等方面存在著差異[16],從而導(dǎo)致酶活差異較大。