傅嘉敏，劉騰飛，韓曉陽

(l. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東 泰安 271018；2. 山東省果樹研究所，山東 泰安 271000)

2017年山東省茶園面積已達2.7×104hm2，茶產(chǎn)業(yè)在推動鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略、發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟等方面發(fā)揮著重要作用。近年來為了滿足市場需求，茶農(nóng)在管理過程中施用大量化肥，影響土壤環(huán)境，降低茶葉品質(zhì)，對茶葉品質(zhì)安全及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全造成嚴重威脅[1]。針對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上施肥用藥不科學(xué)、不合理現(xiàn)象，國家制定了“雙減”項目，通過推進減肥減藥，逐步改善土壤理化環(huán)境，以提高農(nóng)作物品質(zhì)。因此，具有特殊功能性的新型菌肥是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向。

幾丁質(zhì)廣泛存在于甲殼類動物的外殼、昆蟲的甲殼和真菌的胞壁中[2]，其在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等方面應(yīng)用十分廣闊，主要是通過微生物分泌幾丁質(zhì)酶來進行降解[3]。目前，在細菌、真菌、放線菌中都發(fā)現(xiàn)許多具有降解幾丁質(zhì)功能的菌株，譬如環(huán)狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、紅色鏈霉菌、米曲霉等[4-9]。滕少輝等[10]篩選出一株幾丁質(zhì)降解菌，經(jīng)鑒定為鞘氨醇單胞菌。該菌能有效抑制番茄枯萎病菌，對水稻根系發(fā)育有較好的促生作用。Mavingui等[11]發(fā)現(xiàn)一株具有幾丁質(zhì)酶活性的多粘類芽孢桿菌，該菌能夠有效抑制根部和種苗病害。張立陽等[12]從玉米秸稈中分離出一株枯草芽孢桿菌，它對卷枝毛霉、尖孢鐮刀菌、米曲霉、黑曲霉的生長具有抑制作用。閆海洋等[13]篩選出一株幾丁質(zhì)降解菌，它對玉米的生物學(xué)性狀及產(chǎn)量表現(xiàn)出一定的促進作用，增產(chǎn)達13.08%。

本試驗擬從山東茶園土壤中篩選出具有降解幾丁質(zhì)功能的菌株，并通過對菌落形態(tài)、生理生化、16S rDNA序列的研究，確定菌株的種屬，進而對菌株的產(chǎn)酶特性進行研究，為深入研究幾丁質(zhì)的生物降解及菌劑的開發(fā)提供菌種支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土樣采集 2017年7月采集山東農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園基地土壤，迅速帶回實驗室進行微生物的篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基 幾丁質(zhì)培養(yǎng)基[14]：蛋白胨10 g，K2HPO40.7 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.3 g，膠體幾丁質(zhì)5.0 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

篩選培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)20 g，Na2HPO42 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.5 g，酵母粉0.5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的初篩 無菌環(huán)境下稱取土壤樣品，采用梯度稀釋法[15]，在分離培養(yǎng)基上進行菌株的初篩。將初篩后的菌株進行保存，供后續(xù)試驗使用。

1.2.2 菌株的復(fù)篩 將初選得到的菌株制備種子液。按照4%的比例將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后進行酶活檢測復(fù)篩[16]。每個菌株做3次重復(fù)測定。

1.2.3 菌落形態(tài)及生理生化鑒定 將菌株點接在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)7 d，肉眼觀察菌落形態(tài)并作好記錄。參考細菌手冊[17，18]進行生理生化鑒定。

1.2.4 分子鑒定 采用細菌DNA試劑盒提取菌株總DNA。采用細菌16S通用引物(16S-27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S-1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)，并參照文獻[19]的反應(yīng)體系進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體中，進行測序。登錄NCBI數(shù)據(jù)庫進行菌株序列的比對，并構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株的親緣關(guān)系。

1.2.5 SDS-PAGE蛋白聚類 首先將菌株進行富集培養(yǎng)，然后離心，加入緩沖液進行細胞裂解。采用聚丙烯酰氨凝膠電泳進行電泳分離。閱讀PAGE膠上條帶信息，對菌株進行聚類分析[20，21]。

1.2.6 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 菌株首先接種于液體種子培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD=0.05；將種子液按照4%的接種量接種于培養(yǎng)基中進行發(fā)酵條件試驗。

(1)pH值對幾丁質(zhì)降解菌產(chǎn)酶能力的影響試驗：設(shè)定pH值為5、6、7、8，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，設(shè)置3個重復(fù)，置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，采用DNS法測定酶活性。

(2)溫度對幾丁質(zhì)降解菌產(chǎn)酶能力的影響試驗：設(shè)定溫度分別為15、20、25、30、35、40℃六個處理，pH值均為7.0，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時間2～3 d ，采用DNS法測定酶活性。

(3) 轉(zhuǎn)速對幾丁質(zhì)降解菌產(chǎn)酶能力的影響試驗：設(shè)定轉(zhuǎn)速為140、160、180、200 r/min，pH值均為7.0，溫度30℃，同樣設(shè)置3個重復(fù)，置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，采用DNS法測定酶活性。

(4) 混合菌對幾丁質(zhì)降解菌產(chǎn)酶能力的影響試驗：將J4和J17菌株分別培養(yǎng)至菌液OD=0.05，將J4與J17按照1∶1的比例接種4%于培養(yǎng)基中進行產(chǎn)酶試驗，與J4菌株和J17菌株單獨培養(yǎng)的產(chǎn)酶能力做比較，采用DNS法測定酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS軟件進行方差分析，采用Mirosoft Excel 2010 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 初篩 本試驗從土壤中分離出20株菌株，并編號為J1—J20(見表1)。經(jīng)透明圈法篩選出4株幾丁質(zhì)降解菌菌株，分別為J4、J15、J17、J19。

表1 菌株初篩結(jié)果

注：“-”為無脫色圈出現(xiàn)。

2.1.2 復(fù)篩 (1) 菌株酶活測定：由表2可以看出，J4、J17、J19 3株菌產(chǎn)酶能力存在顯著差異。其中J4菌株酶活最高，可達49.31 U/mL，顯著高于J17和J19，J17顯著高于J19。

(2) 菌株聚類 SDS-PAGE：細胞蛋白電泳可將細菌從蛋白水平上進行區(qū)分。由圖1可見，菌株J4、J17和J19被分成2大類群。菌株J17、J19屬于類群Ⅰ，J4屬于類群Ⅱ，說明菌株J17與J19有可能屬于同一種屬。

綜上分析，本試驗選擇J4和J17作為終選菌株，并做進一步鑒定及產(chǎn)酶特性研究。

表2 菌株酶活結(jié)果

圖1 幾丁質(zhì)降解菌全細胞蛋白電泳圖譜(a)及聚類分析樹形圖(b)

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)鑒定 由圖2可見，J4菌落為淡黃色圓形，其表面光滑，邊緣整齊，不透明，菌落呈凸起狀。J17菌落為乳白色橢圓形，其表面褶皺，邊緣不整齊，不透明，菌落呈凸起狀。

圖2 菌落形態(tài)

2.2.2 菌株生理生化鑒定 菌株J4為革蘭氏陰性菌，好氧，V-P陽性，可利用N-乙酰葡萄糖胺、阿拉伯糖、纖維二糖、蔗糖、葡萄糖，脲酶為陰性，能水解淀粉。菌株J17為革蘭氏陽性菌，好氧，接觸酶陽性，V-P陽性，可利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、半乳糖，能水解淀粉。

2.2.3 菌株分子鑒定 經(jīng)測序檢測，菌株J4和J17的序列長度為1 400 bp和1 420 bp。將所得序列進行 BLAST 比對，結(jié)果表明，J4屬于鞘氨醇桿菌屬，J17屬于芽孢桿菌屬。從菌株系統(tǒng)發(fā)育樹可知(圖 3)，菌株J4與Sphignobacterium親緣關(guān)系最近，菌株J17與Bacillus親緣關(guān)系最近。

圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株產(chǎn)酶特性研究

2.3.1 pH值對終選菌株產(chǎn)酶能力的影響 由圖4a可知，J4、J17菌株隨pH值的升高，酶活增加，在pH值7.0時有較高的產(chǎn)酶能力，酶活可達4.31 U/mL和4.34 U/mL，高于或低于pH值 7.0時酶活均有不同程度的下降。表明pH值7.0為J4、J17菌株產(chǎn)酶的最適pH值。

2.3.2 溫度對終選菌株產(chǎn)酶能力的影響 由圖4b可知，溫度影響著菌株的產(chǎn)酶能力。隨著溫度升高，菌株J4的產(chǎn)酶能力呈直線上升，在30℃時達到最高，之后出現(xiàn)下降，表明在30℃下J4的產(chǎn)酶能力最高。菌株J17在15～20℃產(chǎn)酶能力變化不大，20～25℃產(chǎn)酶能力迅速提升，在25℃時達到產(chǎn)酶能力的最高點。

2.3.3 轉(zhuǎn)速對終選菌株產(chǎn)酶能力的影響 由圖4c可知，菌株J4隨轉(zhuǎn)速增加，產(chǎn)酶能力有不同程度的增加，在200 r/min時酶活最高；菌株J17隨轉(zhuǎn)速增加產(chǎn)酶能力不斷增加，在180 r/min時酶活達最高值，之后酶活下降。因此，J4菌株的最適轉(zhuǎn)速為200 r/min，J17菌株最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.3.4 混合菌株對幾丁質(zhì)產(chǎn)酶能力的影響 由表3可以看出，J4+J17混合菌株產(chǎn)酶能力與J4、J17單菌株產(chǎn)酶能力相比差異顯著，分別高出9%和23%。說明兩菌株混合后產(chǎn)酶能力得到提升。

表3 混合菌株對幾丁質(zhì)產(chǎn)酶能力的影響

3 討論與結(jié)論

幾丁質(zhì)廣泛存在于自然界中，所降解產(chǎn)物對病害的抑制和植株的生長發(fā)育，具有良好的促進作用。滕少輝等[10]篩選出一株幾丁質(zhì)降解菌，經(jīng)鑒定為鞘氨醇單胞菌。Mavingui[11]和張立陽[12]等分別發(fā)現(xiàn)了具有幾丁質(zhì)酶活性的高效菌株，經(jīng)鑒定均屬于芽孢桿菌屬，這些菌株對病害的防治以及植株的生長都有良好的促進作用。本試驗從山東茶園土壤中篩選出具有幾丁質(zhì)降解功能的菌株J4和J17。通過形態(tài)鑒定、生理生化鑒定和分子鑒定，發(fā)現(xiàn)J4和J17分別屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphignobacterium)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。本研究得到的菌株與前人從自然界中篩選到的結(jié)果有一致性，說明這兩個屬中普遍存在著具有幾丁質(zhì)降解功能的菌株。

前人從自然界中篩選到諸多具有幾丁質(zhì)降解功能的菌株，從試驗結(jié)果來看，各菌株的產(chǎn)酶能力存在較大差別。張立陽等[12]篩選到的Bacillussubtilis，幾丁質(zhì)降解酶活可達3.23 U/mL；孫菽蔚等[22]篩選到的Pseudoaltermonas，酶活可達116.2 U/mL；王海東等[16]篩選到的Aeromonashydrophlilla，產(chǎn)酶條件優(yōu)化后酶活可達0.39 U/mL。本試驗通過對J4和J17產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，確定了菌株J4在pH 值7.0、溫度30℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)，其產(chǎn)酶活性達到最高。菌株J17在pH值 7.0、溫度25℃～30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)，其產(chǎn)酶活性達到最高。兩株最高酶活分別可達5.43 U/mL和4.80 U/mL。試驗結(jié)果與前人有較大差別，有可能與菌株存在的環(huán)境、分離篩選所用的底物等方面存在著差異[16]，從而導(dǎo)致酶活差異較大。