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缺血性腦血管病是最常見的腦血管病之一。腦缺血區(qū)由中心缺血區(qū)和周圍缺血半暗帶組成。缺血半暗帶是腦卒中治療的靶點，如果采取有效治療，可挽救缺血半暗帶瀕臨死亡腦組織[1]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細胞特異性促有絲分裂源，能夠與血管內(nèi)皮細胞上的特異性受體結合，可促進毛細血管生成，而毛細血管生成可恢復缺血區(qū)腦組織血液供應[2]。注射用丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的丹參多酚酸鹽類化合物，主要成分是丹參乙酸鎂，具有改善微循環(huán)、抗栓、抗氧化、抗炎和抑制缺血再灌注損傷等作用[3]。以往研究證實，丹參多酚酸鹽能縮小大鼠局部腦缺血后腦梗死面積，并可延長低壓缺氧小鼠存活時間[4-5]。本實驗采用大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，觀察注射用丹參多酚酸鹽在大鼠腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護作用；并通過檢測腦缺血半暗帶VEGF變化，探討丹參多酚酸鹽的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 72只健康雄性SD大鼠(體重330 g左右)，由西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供。大鼠晝夜循環(huán)光照，自由飲水和進食。

1.2 藥物及試劑 丹參多酚酸鹽(上海綠谷生物公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，上?；瘜W試劑公司)；兔抗大鼠VEGF(武漢博士德生物工程有限公司)；山羊抗兔二抗和DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 大鼠MCAO模型制備及分組 MCAO模型制備采用改良Longa法[6]，采取尼龍線線栓法夾閉大鼠左側頸內(nèi)動脈。頸部正中切口3 cm～4 cm，分離皮下組織，暴露左側頸總動脈，結扎左側頸總動脈近心端和遠心端，用眼科剪在左側頸總動脈上剪一斜口，插入栓線，直至遇到阻力且栓線進入18 mm～20 mm，縫合皮下組織及皮膚，建立MCAO模型。局灶性腦缺血為MCAO 48 h；局灶性腦缺血再灌注為MCAO 2 h后再灌注48 h(MCAO/R)。Sham組手術步驟同MCAO，但不行血管內(nèi)插入栓線。大鼠隨機分為6組：Ⅰ組(Sham+生理鹽水)、Ⅱ組(Sham+丹參多酚酸鹽)、Ⅲ組(MCAO+生理鹽水)、Ⅳ組(MCAO+丹參多酚酸鹽)、Ⅴ組(MCAO/R +生理鹽水)和Ⅵ組(MCAO/R+丹參多酚酸鹽)。注射用丹參多酚酸鹽溶于生理鹽水，濃度3 mg/mL。每只大鼠腹腔注射2.0 mL～2.4 mL生理鹽水或丹參多酚酸鹽，注射2 d，每日2次。

1.4 神經(jīng)行為學評分 在大鼠MCAO或MCAO/R后48 h進行神經(jīng)功能評分，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：提尾時病灶對側前肢不能完全伸直；2分：向病灶對側轉圈征象；3分：向病灶對側傾倒；4分：不能自發(fā)行走及意識喪失。

1.5 TTC染色 神經(jīng)行為學評分后，將大鼠斷頭取腦，-20 ℃冷凍15 min后進行冠狀切片，腦片1.5 mm厚，將腦片置于1% TTC磷酸鹽緩沖液(PBS)中，暗室孵育10 min，正常腦組織可染為深紅色，腦梗死區(qū)不染色。根據(jù)文獻[7]方法計算各組大鼠的腦梗死體積。

1.6 免疫組化 將大鼠腦組織在4%多聚甲醛中固定，隨后分別在20%、30%蔗糖中存放至沉底。將腦組織用OCT包埋，冰凍切片機切20 μm腦片，腦片用丙酮浸泡20 min，PBS洗3次，再用甲醛30 mL+PBS 10 mL+30% H2O2500 μL浸泡10 min，PBS洗3次。應用二步法進行免疫組化檢測：兔抗大鼠VEGF抗體(1∶1 000)室溫孵育6 h ，PBS洗3次，加山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗3次，DAB顯色，裱片，梯度脫水，透明，中性樹膠封片。每張切片在高倍視野下隨機選取5個視野，觀察每個視野VEGF陽性細胞數(shù)，取平均數(shù)。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 大鼠神經(jīng)功能評分顯示，Ⅰ組和Ⅱ組大鼠神經(jīng)學表現(xiàn)基本正常，神經(jīng)行為學評分均為12.50分；與Ⅰ組、Ⅱ組比較，Ⅲ組和Ⅳ組大鼠神經(jīng)學評分明顯增高(P<0.05)；與Ⅲ組和Ⅳ組相比，Ⅴ組和Ⅵ組大鼠神經(jīng)學評分明顯降低(P<0.05)，而且Ⅵ組低于Ⅴ組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分情況

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 TTC染色顯示，Ⅰ組和Ⅱ組大鼠腦切片染色為均勻紅色，無缺血灶；Ⅲ組和Ⅳ組大鼠有明顯局灶性腦缺血。與Ⅲ組和Ⅳ組相比，Ⅴ組和Ⅵ組大鼠腦梗死體積明顯減少(P<0.05)，且Ⅵ組梗死體積小于Ⅴ組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠大腦TTC染色

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2.3 各組大鼠腦缺血半暗帶VEGF表達比較 免疫組化結果顯示，各組大鼠相關腦區(qū)均存在VEGF陽性表達，Ⅰ組和Ⅱ組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Ⅰ組和Ⅱ組相比，Ⅲ組和Ⅳ組VEGF陽性表達均增加(P<0.01)，且Ⅳ組較Ⅲ組VEGF陽性表達增加(P<0.05)；與Ⅰ組和Ⅱ組相比，Ⅴ組和Ⅵ組VEGF陽性表達均增加(P<0.05)，且Ⅵ組較Ⅴ組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見圖2、表3。

圖2 各組大鼠大腦免疫組化染色情況

組別nVEGF陽性表達Ⅰ組621.33±4.18Ⅱ組622.17±5.12Ⅲ組639.50±7.011)Ⅳ組648.67±7.341)2)Ⅴ組637.17±6.881)Ⅵ組649.33±8.071)3) 與Ⅰ組、Ⅱ組比較,1)P<0.01;Ⅳ組與Ⅲ組比較,2)P<0.05;Ⅵ組與Ⅴ組比較,3)P<0.01。

3 討 論

缺血性腦血管病極大地危害著人們健康。在腦缺血時存在多種腦損傷疾病的病理生理，如何減輕腦缺血后神經(jīng)損傷，一直是臨床研究的重點和難點。臨床研究證實，注射用丹參多酚酸鹽可改善腦卒中病人神經(jīng)功能缺損，增加腦血管流量[8]，但是其作用機制仍不明確。本研究通過評估丹參多酚酸鹽對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死體積的影響，觀察丹參多酚酸鹽對大鼠急性期腦損傷的神經(jīng)保護作用，并檢測大鼠腦缺血半暗帶VEGF表達，探討丹參多酚酸鹽可能的作用機制。

研究結果顯示，大鼠MCAO或MCAO/R后神經(jīng)學評分及腦梗死體積均明顯增高，而腹腔注射丹參多酚酸鹽可改善大鼠MCAO或MCAO/R后大鼠神經(jīng)學評分，縮小腦梗死體積。正常生理情況下，由于大鼠血腦屏障的存在，絕大多數(shù)藥物較難通過血腦屏障，但是在腦缺血性損傷時，其通透性將增高，難以通過血腦屏障藥物就可以進入腦組織[9]。近年來相關研究表明，腦組織損傷后可出現(xiàn)再塑性，神經(jīng)元發(fā)生機制與血管再通有密切關聯(lián)，所以血管生成為腦損傷修復提供了新的靶點[10]。腦缺血再灌注損傷后，促進血管生成可能與以下因素有關，包括生長因子和黏附分子等。其中最具代表性的生長因子是VEGF。VEGF是一種特異血管內(nèi)皮細胞有絲分裂素，可誘導血管生成，還可促進神經(jīng)再生，并抑制細胞凋亡[11]。目前已經(jīng)證實，缺血性腦損傷能上調神經(jīng)元VEGF表達[12]，這與本研究結果一致。最近有研究報道，創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型中側腦室注射一定劑量VEGF，能改善神經(jīng)行為學功能，主要表現(xiàn)為神經(jīng)細胞凋亡減少，同時血管密度增加[13]。上述研究提示，VEGF既有血管形成作用，又有神經(jīng)營養(yǎng)作用。本研究中，MCAO介導的腦缺血再灌注大鼠的血腦屏障遭到破壞，丹參多酚酸鹽可通過血腦屏障，作用于缺血半暗帶，通過上調該區(qū)域VEGF表達，從而對瀕臨壞死的神經(jīng)細胞發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，丹參多酚酸鹽可能通過VEGF在大鼠腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。