廖 勇，叢 林，敖俊紅，彭卓穎，郎德休，楊蓉婭

毛孢子菌屬是重要的病原酵母菌，其可引起人類深部組織（器官）的感染，導(dǎo)致侵襲性毛孢子菌病[1]，最常見的感染類型是毛孢子菌菌血癥；雖然發(fā)病率較低，但其病死率可高達(dá)50%～80%[2]。阿薩希毛孢子菌（Trichosporonasahii，T. asahii）是該屬內(nèi)臨床最常見分離的病原菌（占比達(dá)到75%）[2]。侵襲性毛孢子菌病常見于免疫功能缺陷的宿主，如血液系統(tǒng)腫瘤、人免疫缺陷病毒（HIV）感染、長期接受免疫抑制劑治療等[1,3]；隨著免疫缺陷宿主的數(shù)量逐年增加，該病近40年的全球報(bào)道數(shù)量逐漸增加，但患者預(yù)后未見明顯改善[2]。2014年歐洲指南和相關(guān)臨床研究推薦三唑類抗真菌藥作為侵襲性毛孢子菌病的治療方案[4]，該類藥物屬于抑菌藥，其他病原真菌的研究發(fā)現(xiàn)，長期應(yīng)用有耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。體外實(shí)驗(yàn)證明，通過氟康唑梯度誘導(dǎo)可獲得阿薩希毛孢子菌耐藥株[5]；同時(shí)，臨床報(bào)道發(fā)現(xiàn)阿薩希毛孢子菌唑類抗真菌藥耐藥株，甚至分離到多藥耐藥臨床株[6,7]，耐藥可最終導(dǎo)致侵襲性毛孢子菌病患者對抗真菌治療反應(yīng)不佳[7]。由于侵襲性毛孢子菌病的首選治療僅限于三唑類抗真菌藥，且臨床應(yīng)用較多的為氟康唑；因此，認(rèn)識阿薩希毛孢子菌的氟康唑耐藥機(jī)制以及探索針對性預(yù)防策略具有重要的臨床意義[8]。

鈣調(diào)磷酸酶是 Ca2+/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶，從單細(xì)胞到多細(xì)胞生物都具有高度的保守性，其是熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）90的一種客戶蛋白[9]；目前認(rèn)為，病原真菌可通過鈣調(diào)磷酸酶通路，產(chǎn)生對三唑類抗真菌藥的耐藥[10]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酯酶抑制劑聯(lián)合常用抗真菌藥對念珠菌和釀酒酵母的抑制具有協(xié)同作用，且鈣調(diào)磷酸酯酶抑制劑聯(lián)合抗真菌藥可抑制耐藥菌株的生長[11]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（他克莫司）可增強(qiáng)兩性霉素B和卡泊芬凈對阿薩希毛孢子菌的體外抗真菌活性[12]。本團(tuán)隊(duì)既往研究同樣發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素）單獨(dú)使用對阿薩希毛孢子菌雖無明顯抑制作用，但聯(lián)合常用抗真菌藥顯示出良好的協(xié)同作用，提示鈣調(diào)磷酸酶在阿薩希毛孢子菌的耐藥中可能發(fā)揮一定作用[13]。本研究通過化學(xué)阻斷的方法探討阿鈣調(diào)磷酸酶在薩希毛孢子菌的氟康唑獲得性耐藥中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 菌株、試劑和培養(yǎng)基

阿薩希毛孢子菌臨床標(biāo)準(zhǔn)株CBS 2479購自荷蘭CBS真菌生物多樣性中心，近平滑念珠菌ATCC 22019由北京大學(xué)第一醫(yī)院真菌研究中心饋贈。環(huán)孢素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和RPMI 1640培養(yǎng)購自美國Sigma-Aldrich公司。YPD液體培養(yǎng)基（1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖）自行配制。

1.2 氟康唑誘導(dǎo)耐藥及抗真菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479分別進(jìn)行氟康唑梯度濃度聯(lián)合環(huán)孢素固定濃度（1 μg/ml）誘導(dǎo)（A組）、氟康唑梯度濃度誘導(dǎo)（B組）、環(huán)孢素固定濃度（1 μg/ml）誘導(dǎo)（C組），每組3個(gè)重復(fù)；氟康唑梯度濃度為初始0.25 μg/ml逐漸翻倍增加直至 128 μg/ml（每次接種后當(dāng)菌液濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠁挝粫r(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)種），同時(shí)設(shè)置空白對照組（培養(yǎng)基中無氟康唑及環(huán)孢素）（D組）；誘導(dǎo)階段每代菌株均檢測氟康唑最小抑菌濃度（MIC）值，誘導(dǎo)終點(diǎn)檢測誘導(dǎo)耐藥株對3種常用唑類抗真菌藥的敏感性。之后，在無藥YPD培養(yǎng)基中對獲得的氟康唑耐藥株進(jìn)行20次傳代（每四代檢測1次菌株氟康唑MIC值），觀察耐藥表型的穩(wěn)定性。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)M27-A3肉湯稀釋法，使用96孔板（costar）檢測上述菌株的體外抗真菌活性（MIC值）。35℃下孵育48 h后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)耐藥

表1 4組誘導(dǎo)階段菌株對氟康唑的敏感性

經(jīng)過氟康唑梯度濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)，A組（氟康唑梯度濃度聯(lián)合環(huán)孢素固定濃度誘導(dǎo)）獲得3株氟康唑耐藥株，氟康唑MIC值上升了8～16倍（16～32 μg/ml）； B組（氟康唑梯度濃度誘導(dǎo)）也獲得3株氟康唑耐藥株，氟康唑MIC值上升了32倍（均為64 μg/ml）； C組（環(huán)孢素固定濃度誘導(dǎo)）和D組（空白對照）未獲得耐藥株，氟康唑MIC值與初始菌株一致（表1）。誘導(dǎo)終點(diǎn)對6株耐藥株進(jìn)行3種唑類抗真菌藥敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，A組耐藥株與初始相比，伊曲康唑MIC值上升了4～8倍（1～2 μg/ml），伏立康唑MIC值上升了2倍（0.25 μg/ml）；B組耐藥株與初始相比，伊曲康唑MIC值上升了8～16倍（2～4 μg/ml），伏立康唑MIC值上升了2～4倍（0.25～0.5 μg/ml）（表 2）。

2.2 耐藥表型穩(wěn)定性

獲得的氟康唑耐藥株分別在無藥培養(yǎng)基中進(jìn)行20次連續(xù)傳代，并對氟康唑敏感性進(jìn)行檢測；研究發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增多，A組耐藥株對氟康唑的耐藥表型不穩(wěn)定，經(jīng)過20次傳代后最終氟康唑MIC值恢復(fù)或接近初始狀態(tài)，且終點(diǎn)時(shí)菌株對伊曲康唑和伏立康唑的MIC值也恢復(fù)或接近初始狀態(tài)；而B組耐藥株對氟康唑的耐藥表現(xiàn)穩(wěn)定，經(jīng)過20次傳代后最終氟康唑、伊曲康唑及伏立康唑MIC值均未見明顯變化（表2、3）。

表2 誘導(dǎo)后及無藥傳代后菌株對3種唑類藥敏敏感性

表3 誘導(dǎo)耐藥株氟康唑耐藥表型穩(wěn)定性

3 討論

近年來隨著免疫抑制人群的不斷增多，深部真菌感染的發(fā)病率也有上升趨勢；對全球近40年毛孢子菌菌血癥報(bào)道文獻(xiàn)的流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，毛孢子菌菌血癥的報(bào)道也逐年增多[2]。侵襲性毛孢子菌病雖然目前發(fā)病率仍較低，但病死率高[1]，且2014年指南僅推薦三唑類抗真菌藥作為首選方案[4]；三唑類抗真菌藥屬于抑菌藥，臨床長期使用可能出現(xiàn)誘導(dǎo)耐藥的現(xiàn)象，既往已在其他病原真菌（念珠菌屬和曲霉屬）中被報(bào)道[14]。近年來臨床也有分離到阿薩希毛孢子菌唑類耐藥株的報(bào)道[6,7,15]；日本的一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了在氟康唑梯度濃度誘導(dǎo)下，阿薩希毛孢子菌出現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象，且認(rèn)為該耐藥表型與該菌ERG11基因突變相關(guān)，但出現(xiàn)突變的機(jī)制尚不明確[5]。

鈣調(diào)磷酸酶作為Hsp90的一種客戶蛋白，已被證實(shí)是病原真菌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)重要的調(diào)節(jié)因子，唑類抗真菌藥抑制病原真菌的麥角固醇合成，影響細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致在應(yīng)激壓力下出現(xiàn)適應(yīng)性應(yīng)答反應(yīng)；研究發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)磷酸酶信號通路與其抗真菌藥耐藥密切相關(guān)[16]。既往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鈣調(diào)磷酸酶催化亞基Cna1p基因突變、調(diào)節(jié)亞基Cnb1p突變或鈣調(diào)磷酸酶抑制劑存在時(shí)，念珠菌的鈣調(diào)磷酸酶的活性會被減弱，進(jìn)而降低了念珠菌對常見唑類藥物（氟康唑和伏立康唑）以及棘白菌素類藥物的耐受性[16]。同時(shí)，鈣調(diào)磷酸酶的減少以及游離細(xì)胞中Mkc1基因表達(dá)的減少可影響病原真菌的非特異性耐藥[9]。

體外藥敏研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素或他克莫司）聯(lián)合唑類抗真菌藥后，念珠菌屬、曲霉屬和隱球菌屬的臨床敏感或耐藥分離株對唑類抗真菌藥的敏感性增加，顯示出不同程度的協(xié)同效應(yīng)[17]。一項(xiàng)念珠菌性心內(nèi)膜炎的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，接受氟康唑聯(lián)合環(huán)孢素治療方案的小鼠預(yù)后明顯優(yōu)于其他單藥治療組，包括氟康唑、兩性霉素B或環(huán)孢素[18]。筆者既往的研究也發(fā)現(xiàn)，對于阿薩希毛孢子菌臨床分離株，環(huán)孢素顯示出與5種常用抗真菌藥（氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B和卡泊芬凈）不同程度的協(xié)同效應(yīng)[13]；另一項(xiàng)研究也同樣發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合他克莫司可明顯提高阿薩希毛孢子菌臨床株對兩性霉素B和卡泊芬凈的體外敏感性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，梯度濃度誘導(dǎo)可獲得阿薩希毛孢子菌耐藥株（氟康唑MIC值為64 μg/ml），且誘導(dǎo)耐藥株對伊曲康唑和伏立康唑的MIC值也出現(xiàn)一定程度升高，說明出現(xiàn)了一定程度的交叉耐藥現(xiàn)象；但如果在梯度濃度誘導(dǎo)的全程給予固定濃度的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素），誘導(dǎo)株的MIC值升高相對較慢，且最終不超過32 μg/ml，該組誘導(dǎo)耐藥株對伊曲康唑和伏立康唑的MIC值雖然也出現(xiàn)升高，但低于單藥誘導(dǎo)組；上述結(jié)果說明阻斷鈣調(diào)磷酸酶可部分阻斷氟康唑應(yīng)激壓力引起的適應(yīng)性耐藥表型，但未能完全阻斷，說明環(huán)孢素阻斷的鈣調(diào)磷酸酶通路應(yīng)答反應(yīng)可能被其應(yīng)激反應(yīng)通路有所代償[19]，既往針對白念珠菌的體外外誘導(dǎo)耐藥研究也獲得了類似的結(jié)果[10]。

同時(shí)，在脫離藥物應(yīng)激壓力環(huán)境（無藥培養(yǎng)基傳代）后，單獨(dú)氟康唑梯度濃度誘導(dǎo)獲得的耐藥株對氟康唑的耐藥表型穩(wěn)定，且與其他2種唑類抗真菌藥的表型也較為穩(wěn)定；但給予固定濃度的環(huán)孢素聯(lián)合氟康唑梯度濃度誘導(dǎo)所獲得的耐藥株，在無藥物壓力反復(fù)傳代后，原有耐藥表型基本轉(zhuǎn)復(fù)，對于氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的MIC值基本恢復(fù)到誘導(dǎo)前的初始值；上述現(xiàn)象說明，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可部分阻斷阿薩希毛孢子菌的適應(yīng)性耐藥表型，其他通路調(diào)控的耐藥表型相對不穩(wěn)定（如ERG11和外排泵適應(yīng)性表達(dá)上調(diào)）[19]，脫離抗真菌藥應(yīng)激壓力后可出現(xiàn)轉(zhuǎn)復(fù)。因此，鈣調(diào)磷酸酶在阿薩希毛孢子菌對氟康唑的適應(yīng)性耐藥中發(fā)揮了一定作用。同時(shí)，應(yīng)用鈣調(diào)磷酸酶可以抑制獲得性耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，且即使出現(xiàn)一定的適應(yīng)耐藥表型，該表型在去除藥物應(yīng)激壓力后可出現(xiàn)轉(zhuǎn)復(fù)，所以該方式可能是減少長期應(yīng)用氟康唑出現(xiàn)阿薩希毛孢子菌耐藥的潛在策略。

綜上所述，本研究的結(jié)果證明抑制鈣調(diào)磷酸酶活性可阻斷長期應(yīng)用氟康唑所誘導(dǎo)出現(xiàn)的阿薩希毛孢子菌耐藥現(xiàn)象。然而，需要進(jìn)一步研發(fā)出選擇性更高，對宿主免疫功能無影響的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑進(jìn)行體內(nèi)和相關(guān)機(jī)制研究，使得將來臨床應(yīng)用成為可能。