吳 娜，鄭 焱，李昌吉

銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，近年來發(fā)現(xiàn)除皮膚損害外，該病還可引起其他系統(tǒng)損害[1]，影響患者健康，但目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療方法需要更多探索。銀屑病主要表現(xiàn)有表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖，真皮新生血管形成，炎癥因子浸潤。 干 擾 素（interferon，IFN）/維A酸（retinoic acid，RA）聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因19（genes associated with retinoid interferon induced mortality，GRIM-19）是近些年新發(fā)現(xiàn)的能夠參與細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡過程的基因[2]。目前研究表明，GRIM-19在人類多種正常組織中表達(dá)，能夠參與IFN/RA調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡過程，但其在銀屑病皮損中的表達(dá)如何尚不清楚。本研究擬通過免疫組化法檢測(cè)尋常性銀屑病患者皮損組織中GRIM-19蛋白的表達(dá)，并將維A酸作用于銀屑病皮損，觀察作用前后皮損中GRIM-19表達(dá)的變化，從而深入研究GRIM-19在銀屑病發(fā)生發(fā)展及維A酸治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 尋常性銀屑病患者43例，男21例，女22例；年齡17～63歲，平均年齡（37.72±10.72）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①已經(jīng)臨床及組織病理明確診斷；②無其他皮膚病及系統(tǒng)性疾??；③本次發(fā)作病程1～3周；④患者本次發(fā)作未接受任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對(duì)受試藥物過敏者；②孕婦及哺乳期婦女。對(duì)照取自20例外科手術(shù)切下的胸腹部正常皮膚，男女各10例；年齡12～51歲，平均年齡（31.80±12.32）歲。兩組年齡、性別等一般狀況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.945，χ2=0.007，P均＞0.05）。本研究通過陜西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.1.2 試劑 GRIM-19兔抗人單克隆抗體（英國Abcam公司），工作濃度1:200；羊抗兔免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 采用隨機(jī)化區(qū)組分組抽取銀屑病患者給予維A酸（0.1%他扎羅汀乳膏）或氧化鋅軟膏[3,4]，每日1次外用，連用4周。治療結(jié)束后所有患者雙盲分組，其中試驗(yàn)組21例，男11例，女10例，年齡16～57歲，平均（35.76±11.07）歲，其余22例為對(duì)照組，男10例，女12例，年齡18～63歲，平均（39.59±10.28）歲，兩組年齡、性別等一般狀況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.176，χ2=0.206，P均＞ 0.05），用藥前，用藥后2周、4周均手術(shù)切取皮損組織。

1.2.2 免疫組化染色 新鮮組織取材后甲醛固定，常規(guī)包埋，切片乙醇逐級(jí)脫蠟、水化。使用含10%正常血清及1%牛血清白蛋白的三乙醇胺緩沖溶液室溫封閉2 h；加入一抗在4 ℃下于冰箱孵育過夜；含0.3%過氧化氫的三乙醇胺緩沖溶液中孵育15 min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性；加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗于室溫下孵育1 h，DAB顯色10 min，沖洗，蘇木精復(fù)染，陰性對(duì)照中用PBS代替一抗。具體操作按說明書進(jìn)行。

1.2.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色、棕黃色或褐色顆粒。通過計(jì)分對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合判定。具體方法為在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，首先按照細(xì)胞陽性率來計(jì)分，≤5%計(jì)0分，＞5%且≤25%計(jì)1分，＞25%且≤50%計(jì)2分，＞50%且≤75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分；再根據(jù)染色強(qiáng)度分級(jí)來計(jì)分，不著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，淺棕黃色計(jì)2分，大量棕褐色計(jì)3分；最后將每個(gè)視野陽性細(xì)胞百分率得分與染色強(qiáng)度得分相乘得到該視野最終計(jì)分，以5個(gè)視野得分的平均值為最終結(jié)果。按照最終得分0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，Kruskal-wallis檢驗(yàn)對(duì)銀屑病皮損中GRIM-19的表達(dá)和維A酸治療前后試驗(yàn)組GRIM-19的表達(dá)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 表示,數(shù)據(jù)經(jīng)過檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊，兩組間t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)對(duì)年齡和性別差異進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病皮損與正常皮膚GRIM-19的表達(dá)

GRIM-19主要定位于細(xì)胞質(zhì)線粒體中，細(xì)胞核中有少量表達(dá)[5]。正常皮膚組織中GRIM-19蛋白為棕色顆粒，表達(dá)于全層表皮，主要存在于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì)中，少數(shù)存在于細(xì)胞核內(nèi)（圖1a）；銀屑病邊緣皮損中GRIM-19蛋白為淡黃色顆粒，表達(dá)于表皮基底層和棘層，染色較正常皮膚組織減弱（圖1b）；銀屑病中間皮損中GRIM-19幾無表達(dá)（圖1c）。對(duì)各組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 銀屑病皮損與正常皮膚GRIM-19的表達(dá) （例）

2.2 維A酸對(duì)皮損GRIM-19表達(dá)的影響

圖1 銀屑病皮損與正常皮膚免疫組化組織病理（SP法×400）

維A酸治療前銀屑病皮損表皮全層細(xì)胞中幾乎無GRIM-19表達(dá)（圖2a），維A酸治療2周后皮損局部表皮基底層和棘層細(xì)胞中可見淡染的棕黃色顆粒（圖2b），維A酸治療4周后皮損變薄，鱗屑減少，全層細(xì)胞中可見深棕黃色顆粒（圖2c）。對(duì)照組處理前后皮損染色未發(fā)生明顯改變。試驗(yàn)組維A酸處理前、處理2周和4周后 GRIM-19表達(dá)情況見表2。

圖2 他扎羅汀乳膏治療前后銀屑病皮損免疫組化組織病理（SP法×400）

表2 維A酸治療前后試驗(yàn)組GRIM-19的表達(dá)

3 討論

GRIM-19是一種參與IFN/RA調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因，其由Angell等在2000年用基因敲除技術(shù)分離篩選出來的。目前已發(fā)現(xiàn)GRIM-19在心臟、骨骼肌等多種正常組織中有明顯表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控過程，而在胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)或缺失狀態(tài)[6,7]。有學(xué)者推測(cè)其表達(dá)的降低或者位點(diǎn)的突變可能是導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化的重要因素[8,9]。銀屑病作為一種具有表皮異常增生特點(diǎn)的皮膚病，筆者的研究發(fā)現(xiàn)GRIM-19在正常皮膚組織中表達(dá)于表皮全層，在銀屑病邊緣皮損中表達(dá)于表皮基底層和棘層，且表達(dá)強(qiáng)度較正常皮膚減弱，在銀屑病中間皮損中不表達(dá)。 研究提示，維A酸對(duì)多種與細(xì)胞增殖分化有關(guān)的因子有重要調(diào)控作用[10]，其對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞起到調(diào)節(jié)增殖、誘導(dǎo)分化的作用。本研究同時(shí)用維A酸治療銀屑病，觀察其對(duì)GRIM-19表達(dá)的影響。結(jié)果顯示治療前銀屑病皮損表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中幾乎不表達(dá)GRIM-19，經(jīng)過2周和4周的治療，隨著臨床癥狀的好轉(zhuǎn)，皮損中GRIM-19表達(dá)逐漸升高，此時(shí)與對(duì)照組相比有明顯差異。因此，推測(cè)GRIM-19可能參與銀屑病表皮細(xì)胞異常增殖、凋亡，是維A酸治療銀屑病過程中的重要影響因子。

Janus蛋白酪氨酸激酶（Janus protein tyrosine kinase, JAK）/信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription, STAT）途徑作為細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，在銀屑病表皮細(xì)胞增殖凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。研究得知，STAT3的反式激活結(jié)構(gòu)域尤其是其中第727 位上的絲氨酸殘基是GRIM-19的特異結(jié)合位點(diǎn)，因此，GRIM-19即通過與STAT3的相互作用，阻礙其核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制依賴STAT3的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞增殖[7,11,12]。推測(cè)在銀屑病發(fā)病初期，GRIM-19表達(dá)逐漸減少，與STAT3結(jié)合減弱，繼而啟動(dòng)JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)下游靶基因Bcl-2、cyclin、c-myc、c-Jun、Fas、VEGF 等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、凋亡、血管增生，從而導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，維A酸可在肺間質(zhì)纖維化、宮頸癌等多種疾病中誘導(dǎo)STAT3表達(dá)下降[13,14]，且在胃腺癌的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)維A酸可下調(diào)JAKSTAT信號(hào)通路下游靶基因B淋巴細(xì)胞瘤（B cell lymphoma，Bcl）-2的表達(dá)[15]，據(jù)此推測(cè)，維A酸對(duì)銀屑病的治療很可能通過提高GRIM-19的表達(dá)，繼而抑制JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化、凋亡趨于正常化。因此，GRIM-19可能是維A酸治療銀屑病的關(guān)鍵作用因子。

綜上所述，GRIM-19在銀屑病患者皮損中表達(dá)下調(diào)，維A酸處理銀屑病皮損可提高GRIM-19的表達(dá)，提示未來GRIM-19可作為生物標(biāo)志用于監(jiān)測(cè)臨床療效，通過外源性導(dǎo)入GRIM-19，阻斷STAT3信號(hào)通路，為銀屑病的治療可能開辟新的思路。