王 化，李夢(mèng)莎，何丹嬈，朱良玉，周麗萍*

（黑龍江省科學(xué)院 自然與生態(tài)研究所 林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150040）

越桔屬（Vaccinium）植物是杜鵑花科（Ericaceae）灌木或小喬木，葉常綠、少數(shù)落葉，主要分布北半球溫帶、亞熱帶、美洲和亞洲的熱帶山區(qū)[1]；漿果球形，果實(shí)顏色為紅色、藍(lán)黑色或紫色，營(yíng)養(yǎng)豐富，含糖、多種維生素、有機(jī)酸、花色苷、礦物質(zhì)等，深受廣大消費(fèi)者喜愛[2-3]。篤斯越桔（Vaccinium uliginosum Linn.）、越桔（Vaccinium vitis-idaea Linn.）和歐洲越桔（Vaccinium myrtillus Linn.）是北半球高緯度地區(qū)的3種重要林下經(jīng)濟(jì)植物[4]，分布廣泛，野生果實(shí)富含天然抗氧化成分，蘊(yùn)儲(chǔ)量大。目前果實(shí)主要用于鮮食、生產(chǎn)食品、天然色素、飲料和釀酒，少量用于提取物生產(chǎn)。隨著對(duì)天然抗氧化劑生理功能研究的不斷深入[5-6]，以花色苷、有機(jī)酸為主要成分的越桔提取物需求量不斷增大，市場(chǎng)前景廣闊。篤斯越桔、越桔和歐洲越桔3者漿果提取物的比較研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)3種漿果花色苷和多酚類物質(zhì)含量測(cè)定及體外抗氧化活性比較，以期為北半球高緯度地區(qū)野生越桔屬漿果資源的開發(fā)及綜合利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越桔、越桔：收集于大興安嶺地區(qū)塔河縣；歐洲越桔：收集于芬蘭赫爾辛基。

XDA-6樹脂：南開大學(xué)樹脂廠；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗壞血酸（vitamin C，VC）：美國(guó)Sigma公司；福林-酚試劑Ⅱ：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、碳酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、水楊酸鈉、硫酸亞鐵等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALC-110電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；S-3L pH計(jì)：上海精密儀器有限公司；UV-Vis EVO300分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-5200超聲波提取儀：北京益植康生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

采用超聲波輔助提取工藝提取，提取液為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，料液比為1∶10（g∶mL），提取溫度40 ℃，提取時(shí)間30 min，提取2次，合并提取液。提取液48℃減壓濃縮后凍干得到3種漿果的粗提物，分別標(biāo)記為H（越桔粗提物）、D（篤斯越桔粗提物）、O（歐洲越桔粗提物）。

1.3.2 純化方法

采用柱層析法對(duì)漿果提取物進(jìn)行分離純化，通過固定相介質(zhì)篩選和流動(dòng)相介質(zhì)優(yōu)化，確定了分離的固定相介質(zhì)為XDA-6型介質(zhì)，依次以蒸餾水、10%乙醇水溶液、30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，收集不同濃度乙醇洗脫液，每種漿果得到3個(gè)分離純化組分（純化1組：10%乙醇水溶液；純化2組：30%乙醇水溶液；純化3組：50%乙醇水溶液），減壓濃縮凍干后一共得到9種漿果純化物，分別標(biāo)記為H-1（越桔10%乙醇提取物）、D-1（篤斯越桔10%乙醇提取物）、O-1（歐洲越桔10%乙醇提取物）；H-2（越桔30%乙醇提取物）、D-2（篤斯越桔30%乙醇提取物）、O-2（歐洲越桔30%乙醇提取物）；H-3（越桔50%乙醇提取物）、D-3（篤斯越桔50%乙醇提取物）、O-3（歐洲越桔50%乙醇提取物）。

1.3.3 花色苷含量測(cè)定方法

各組提取物中花色苷含量以pH示差法[7-8]進(jìn)行測(cè)定。

不同pH值溶液的配制方法：

pH 1.0：0.2mol/LHC1∶0.2mol/LKCl=67∶25（V/V）；

pH 4.5：0.2mol/LHAc∶0.2mol/LNaAc·3H2O=1∶1，（V/V）。

使用移液器吸取供試樣品配制的溶液2 mL，以pH1.0及pH4.5緩沖液進(jìn)行稀釋，至一定倍數(shù)混勻。用2 mL溶劑作為空白組，于波長(zhǎng)510 nm和700 nm處分別測(cè)定吸光度值，每份供試樣品3次平行操作。

花色苷含量（以矢車菊素-3-葡萄糖苷計(jì)）計(jì)算公式如下：

式中：ACY為花色苷含量，mg/mL；Mw為Cya-3-glu的摩爾分子質(zhì)量（449.2）；DF為稀釋倍數(shù)；26 900為Cya-3-glu的摩爾消光系數(shù)；L為光程，1 cm。

1.3.4 多酚含量測(cè)定方法

多酚類物質(zhì)含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法[9]，準(zhǔn)確加入1 mL供試樣品溶液于25 mL納氏比色管內(nèi)，然后依次加入50%福林-酚顯色劑1 mL、7.5%碳酸鈉溶液3 mL和蒸餾水5 mL，加蓋后振蕩、搖勻、避光，2 h后以分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)765 nm處的吸光度值，計(jì)算總多酚含量，每份供試樣品3次平行操作。

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，沒食子酸質(zhì)量濃度（x）作為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）作為縱坐標(biāo)，線性回歸方程：y=0.011 3x+0.008 1（R2=0.998 9）。

1.3.5 總還原能力測(cè)定方法

總還原能力參照文獻(xiàn)[10-11]略有改動(dòng)。準(zhǔn)確量取質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的供試樣品溶液0.5 mL于25 mL納氏比色管中，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH為6.6）2.5 mL，混勻后加入1%K3Fe（CN）6溶液2.5 mL?；靹?，水浴溫度50℃，保持20 min，之后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL。充分振蕩混合后1 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL加入比色管中，然后加入蒸餾水5 mL，0.1%的FeCl3溶液1 mL，混勻后以分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)700 nm處的吸光度值，記為A1；用蒸餾水代替不同濃度的供試樣品溶液，同法操作測(cè)定吸光度值，記為A0。每份供試樣品3次平行操作，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照品?？傔€原力計(jì)算公式如下：

式中：m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 羥自由基清除能力測(cè)定方法

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[12]略有改動(dòng)，進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)體系由以下試劑混合組成：0.5 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，0.8 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，0.5 mL蒸餾水，供試樣品溶液1.0 mL，0.2 mL 20 mmol/L水楊酸鈉溶液，共3.0 mL。將該反應(yīng)體系混合均勻后，37℃水浴溫育1 h，取出于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定混合物吸光度值A(chǔ)1；將上述體系中的1.0 mL供試樣品溶液以蒸餾水替代，同法操作，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；將上述體系中0.2 mL水楊酸鈉溶液用相同體積的蒸餾水代替，其余同法操作，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。每份供試樣品3次平行操作，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照品。按照下面公式計(jì)算羥自由基清除率：

1.3.7 DPPH自由基清除能力測(cè)定方法

按照BLOIS MS等[13]的方法測(cè)定供試樣品對(duì)DPPH自由基的清除作用。精確稱量DPPH試劑粉末，臨用前于棕色瓶中配制濃度為8.62×10-2mmol/L的DPPH乙醇溶液，向試管中加入DPPH試劑2.0 mL，不同供試樣品溶液2.0 mL，混合均勻，避光放置30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定混合物的吸光度值A(chǔ)1；同法操作，用2.0 mL乙醇代替供試樣品，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；不加DPPH溶液，用2.0 mL乙醇代替，加入不同濃度供試樣品溶液，同法操作測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。每份供試樣品3次平行操作，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照品。通過如下公式計(jì)樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力：

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均采用x±s表示，檢查方差齊性，組間比較采用最小顯著性差異法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性成分含量檢測(cè)結(jié)果與分析

2.1.1 花色苷含量

3種漿果的純化產(chǎn)物共9個(gè)樣品的花色苷含量如圖1所示。

圖1 3種漿果純化提取物花色苷含量Fig.1 Anthocyanins contents in the purified extracts of three kinds of berries

由圖1可知，篤斯越桔和歐洲越桔各提取物組分中花色苷含量均極顯著（P＜0.01）高于越桔各提取物組分，歐洲越桔O-1、O-2、O-3組的花色苷含量均略高于篤斯越桔相應(yīng)各組，O-3中花色苷含量（9.34±0.38%）低于D-3（9.42±0.26%），但差異不顯著（P＞0.05）。各純化組分中花色苷含量依次為30%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物，各組間差異顯著（P＜0.05）。

2.1.2 總多酚類物質(zhì)含量

3種漿果的純化產(chǎn)物共9個(gè)樣品的總多酚類物質(zhì)含量如圖2所示。

圖2 3種漿果純化提取物總多酚類物質(zhì)含量Fig.2 Total polyphenols contents in the purified extracts of three kinds of berries

由圖2可知，結(jié)合花色苷含量結(jié)果分析，可見篤斯越桔和歐洲越桔中多酚類物質(zhì)以花色苷為主，越桔中則相反；越桔中除花色苷以外的多酚類物質(zhì)含量高于篤斯越桔和歐洲越桔。不同純化組分間多酚含量也存在較大差異（P＜0.05），越桔純化組分中總多酚含量依次為30%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物，而篤斯越桔和歐洲越桔為30%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物。差異形成原因主要是越桔提取物中以酚酸為主，極性相對(duì)較低。3種漿果的純化產(chǎn)物中均為30%乙醇洗脫物的總多酚類物質(zhì)含量最高，O-2（（35.86±0.33）%）＞D-2（（33.32±0.59）%）＞H-2（（27.96±0.48）%）。

2.2 體外抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果與分析

2.2.1 清除羥自由基活性

羥自由基有極強(qiáng)的氧化能力即得電子能力，是自然界一種重要的活性氧。通過殘留的羥自由基與水楊酸之間相互作用，產(chǎn)生的2,3-二羥基苯甲酸在波長(zhǎng)510 nm處有特征吸收峰，3種漿果純化提取物對(duì)羥基自由基的清除作用如圖3所示。

圖3 3種漿果純化提取物的羥自由基清除率Fig.3 Hydroxyl radical scavenging rates of the purified extracts of three kinds of berries

由圖3可知，3種漿果各組提取物均有較好的羥自由基清除活性，各提取物質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，O-2（（93.22±1.39）%）和D-2（（91.04±1.26）%）羥自由基清除率最高，顯著高于VC（（87.52±2.04）%）（P＜0.05），O-0最低，僅為（45.57±0.78）%。H-2的抗氧化活性也高于其他純化組，表明3種漿果的30%乙醇洗脫物具有最好的清除羥自由基能力，這與3種漿果的30%乙醇洗脫物中花色苷和多酚含量最高的檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性。

2.2.2 清除DPPH自由基活性

DPPH乙醇溶液呈紫色，在波長(zhǎng)517 nm處有強(qiáng)烈吸收，是一種穩(wěn)定的以N為中心的質(zhì)子自由基，當(dāng)清除劑存在時(shí)，其提供的電子與DPPH孤對(duì)電子配對(duì)而導(dǎo)致其褪色，褪色程度與接受電子量呈定量關(guān)系[14]，因而用分光光度計(jì)對(duì)3種漿果提取物清除DPPH自由基活性進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 3種漿果純化提取物的DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging rates of the purified extracts of three kinds of berries

由圖4可知，各提取物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，O-2、D-2、O-3的DPPH自由基清除率分別為（98.09±1.54）%、（97.63±1.65）%、（97.31±1.23）%，表明3者的抗氧化能力很強(qiáng)，幾乎清除了體系內(nèi)所有的自由基，3者間差異不顯著（P＞0.05）。O-1、O-2、O-3、D-1和D-2清除DPPH自由基的能力均高于VC，H-2和H-3組的活性與VC相當(dāng)，差異不顯著（P＞0.05）。另外，H-1和H-2的清除能力低于相應(yīng)篤斯越桔和歐洲越桔各組純化產(chǎn)物，但在50%乙醇洗脫物組中，清除活性為O-3＞H-3＞D-3，越桔組優(yōu)于篤斯越桔組，H-3組中豐富的酚酸類物質(zhì)起到了較好的作用。

2.2.3 總還原能力

還原能力是衡量抗氧化能力的重要指標(biāo)，具有還原性的物質(zhì)可以發(fā)生氧化反應(yīng)，從而保護(hù)其他物質(zhì)，達(dá)到抗氧化的目的。當(dāng)體系中存在還原性物質(zhì)時(shí)，鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀，在酸性條件下與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，于波長(zhǎng)700 nm處有最大吸收峰。每克提取物干物質(zhì)的總還原力如圖5所示。

圖5 3種漿果純化提取物的總還原力Fig.5 The total reducing power of the purified extracts of three kinds of berries

由圖5可知，篤斯越桔和越桔各組提取物還原能力為30%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物，而歐洲越桔為30%乙醇洗脫物＞50%乙醇洗脫物＞10%乙醇洗脫物，但總還原能力最高為歐洲越桔的30%乙醇洗脫物，與清除羥自由基和DPPH自由基檢測(cè)結(jié)果相一致。

與篤斯越桔和歐洲越桔相比，越桔的花色苷含量較少，但其他酚酸類物質(zhì)含量較多[15-16]，因此越桔提取物的總還原能力同樣很強(qiáng)，相比于歐洲越桔和篤斯越桔較高的原料價(jià)格，越桔提取物可以憑借其較好的抗氧化能力和較低的價(jià)格贏得更多地消費(fèi)市場(chǎng)。

2.3 活性成分含量與體外抗氧化結(jié)果相關(guān)性分析

3種漿果中花色苷和多酚類物質(zhì)與抗氧化指標(biāo)（總還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率）之間的相關(guān)性分析見圖6。

圖6 3種漿果中活性成分與抗氧化指標(biāo)之間的相關(guān)性Fig.6 Correlation between active components in three kinds of berries and antioxidant indexes

由圖6可知，多酚類物質(zhì)含量與3種抗氧化指標(biāo)間的相關(guān)性高于花色苷，總還原力與各組提取產(chǎn)物多酚類物質(zhì)含量線性關(guān)系方程的R2最高，為0.905，可見漿果提取物中多酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力相關(guān)性極好，可以用于此類提取物質(zhì)量檢測(cè)的參考指標(biāo)。

3 結(jié)論

通過對(duì)3種野生越桔屬植物漿果提取物花色苷和多酚類物質(zhì)含量測(cè)定及抗氧化活性比較研究，綜合分析結(jié)果表明，越桔、篤斯越桔和歐洲越桔3種漿果的9種純化組分中，篤斯越桔和歐洲越桔30%乙醇洗脫物組分的抗氧化活性最強(qiáng)，總還原力分別為（1 197.4±25.93）/g和（1 237.5±27.13）/g，與VC（1219.1±32.62）/g無顯著差異（P＞0.05）；DPPH自由基清除率分別為（97.63±1.65）%和（98.09±1.54）%，高于VC（（86.66±1.84）%）和越桔（（86.68±2.39）%）；羥自由基清除率分別為（91.04±1.26）%和（93.22±1.39）%，高于VC（（87.52±2.04）%）和越桔（（81.80±1.23）%）?？傮w分析，篤斯越桔與歐洲越桔抗氧化活性相近，篤斯越桔和歐洲越桔抗氧化活性高于越桔。